बातम्या

Nature.com ला भेट दिल्याबद्दल धन्यवाद.तुम्ही वापरत असलेल्या ब्राउझर आवृत्तीमध्ये मर्यादित CSS सपोर्ट आहे.सर्वोत्तम अनुभवासाठी, आम्ही शिफारस करतो की तुम्ही अद्ययावत ब्राउझर वापरा (किंवा इंटरनेट एक्सप्लोररमध्ये सुसंगतता मोड अक्षम करा).दरम्यान, सतत समर्थन सुनिश्चित करण्यासाठी, आम्ही साइटला शैली आणि JavaScript शिवाय रेंडर करू.
सक्रिय एस्टर किंवा फिनॉक्सी रॅडिकल्सवर आधारित एन्झाइमॅटिक प्रॉक्सिमिटी लेबलिंग पद्धती सजीव पेशींमध्ये सबसेल्युलर प्रोटीओम्स आणि प्रोटीन इंटरॅक्टर्स मॅप करण्यासाठी मोठ्या प्रमाणावर वापरल्या जातात.तथापि, सक्रिय एस्टर कमी प्रतिक्रियाशील असतात, परिणामी विस्तृत लेबलिंग त्रिज्या होते आणि पेरोक्साईड उपचाराने तयार होणारे फिनोक्सी रॅडिकल्स रेडॉक्स मार्गांमध्ये व्यत्यय आणू शकतात.येथे आम्ही प्रॉक्सिमिटी लेबलिंग अवलंबित फोटोएक्टिव्हेशन (PDPL) पद्धतीचा अहवाल देत आहोत, जी आनुवांशिकरित्या miniSOG फोटोसेन्सिटायझर प्रोटीनला स्वारस्य असलेल्या प्रोटीनशी जोडून विकसित केली आहे.निळ्या प्रकाशाने ट्रिगर आणि एक्सपोजर वेळेद्वारे नियंत्रित, सिंगलट ऑक्सिजन तयार केला जातो आणि नंतर अॅनिलिन प्रोबद्वारे हिस्टिडाइनच्या अवशेषांचे स्पॅटिओटेम्पोरली निराकरण केले जाते.आम्ही ऑर्गेनेल-विशिष्ट प्रोटीओम मॅपिंगद्वारे त्याची उच्च निष्ठा प्रदर्शित करतो.PDPL ची TurboID सह शेजारी-बाय-साइड तुलना PDPL चे अधिक विशिष्ट आणि व्यापक प्रोटीओमिक कव्हरेज दर्शवते.पुढे, आम्ही रोग-संबंधित ट्रान्सक्रिप्शनल कोएक्टिवेटर BRD4 आणि E3 Parkin ligase वर PDPL लागू केले आणि पूर्वी अज्ञात संवादक आढळले.ओव्हरएक्सप्रेशन स्क्रीनिंगद्वारे, दोन अज्ञात सबस्ट्रेट्स, Ssu72 आणि SNW1, पार्किनसाठी ओळखले गेले, ज्यांचे ऱ्हास हे सर्वव्यापी-प्रोटीसोम मार्गाद्वारे मध्यस्थ होते.
प्रथिने नेटवर्कचे अचूक वैशिष्ट्य अनेक मूलभूत सेल्युलर प्रक्रियांना अधोरेखित करते.म्हणून, प्रथिनांच्या परस्परसंवादाचे अत्यंत अचूक स्पॅटिओटेम्पोरल मॅपिंग जैविक मार्ग, रोग पॅथॉलॉजी आणि उपचारात्मक हेतूंसाठी या परस्परसंवादांमध्ये व्यत्यय आणण्यासाठी आण्विक आधार प्रदान करेल.यासाठी, जिवंत पेशी किंवा ऊतींमधील ऐहिक परस्परसंवाद शोधण्यात सक्षम पद्धती अत्यंत इष्ट आहेत.अ‍ॅफिनिटी प्युरिफिकेशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (AP-MS) ऐतिहासिकदृष्ट्या इंटरेस्टच्या प्रोटीनचे बंधनकारक भागीदार (POIs) ओळखण्यासाठी वापरली गेली आहे.परिमाणात्मक प्रोटिओमिक्स पद्धतींच्या विकासासह, बायोप्लेक्स3.0 तयार केले गेले, जो एपी-एमएसवर आधारित प्रोटीन नेटवर्कचा सर्वात मोठा डेटाबेस आहे.जरी एपी-एमएस खूप शक्तिशाली असले तरी, वर्कफ्लोमधील सेल लिसिस आणि डिलिशन टप्पे कमकुवत आणि क्षणिक बंधनकारक परस्परसंवादांकडे पक्षपाती असतात आणि लिसिसच्या आधी कंपार्टमेंटलायझेशन नसलेल्या बनावट परस्परसंवाद जोड्यांसह पोस्ट-लिसिस आर्टिफॅक्ट्स सादर करतात.
या समस्यांचे निराकरण करण्यासाठी, क्रॉसलिंकिंग गटांसह अनैसर्गिक अमीनो ऍसिड (UAA) आणि एन्झाईमॅटिक जवळील लेबलिंग (PL) प्लॅटफॉर्म (उदा. APEX आणि BioID)5 विकसित केले गेले आहेत.जरी अनेक परिस्थितींमध्ये UAA पद्धत यशस्वीरित्या लागू केली गेली आहे आणि थेट प्रथिने चिकटवण्याबद्दल माहिती प्रदान करते, तरीही UAA अंतर्भूत साइटचे ऑप्टिमायझेशन आवश्यक आहे.अधिक महत्त्वाचे म्हणजे, ही एक स्टोइचिओमेट्रिक लेबलिंग पद्धत आहे ज्यामध्ये लेबलिंग इव्हेंट्सचे उत्प्रेरक रिव्हर्सल नसते.याउलट, बायोआयडी पद्धतीसारख्या एन्झाईमॅटिक पीएल पद्धती, इंजिनियर केलेल्या बायोटिन लिगेसला POI7 मध्ये जोडतात, जे नंतर बायोटिन सक्रिय करून प्रतिक्रियाशील बायोटिनिल-एएमपी एस्टर इंटरमीडिएट तयार करतात.एंझाइम अशा प्रकारे सक्रिय बायोटिन "क्लाउड" उत्प्रेरित करते आणि सोडते जे समीपस्थ लाइसिन अवशेषांना लेबल करते.तथापि, पुरेसा लेबल केलेला सिग्नल मिळविण्यासाठी BioID ला 12 तासांपेक्षा जास्त वेळ लागतो, जे टेम्पोरल रिझोल्यूशनसह त्याचा वापर प्रतिबंधित करते.यीस्ट डिस्प्लेवर आधारित निर्देशित उत्क्रांती वापरून, टर्बोआयडी अधिक कार्यक्षम होण्यासाठी बायोआयडीवर आधारित डिझाइन केले गेले होते, 10 मिनिटांच्या आत बायोटिनसह कार्यक्षम लेबलिंग करण्यास अनुमती देते, अधिक गतिशील प्रक्रियांचा अभ्यास करण्यास अनुमती देते.कारण टर्बोआयडी अत्यंत सक्रिय आहे आणि अंतर्जात बायोटिन पातळी निम्न-स्तरीय लेबलिंगसाठी पुरेशी आहे, पार्श्वभूमी लेबलिंग एक संभाव्य समस्या बनते जेव्हा एक्सोजेनस बायोटिन जोडून उच्च वर्धित आणि कालबद्ध लेबलिंग आवश्यक असते.याव्यतिरिक्त, सक्रिय एस्टर खराब प्रतिक्रियाशील असतात (t1/2 ~ 5 मिनिट), ज्यामुळे मोठ्या लेबलिंग त्रिज्या होऊ शकतात, विशेषत: बायोटिन 5 सह शेजारच्या प्रथिनांच्या संपृक्ततेनंतर. दुसर्या दृष्टिकोनामध्ये, इंजिनियर एस्कॉर्बेट पेरोक्सिडेसचे अनुवांशिक संलयन (म्हणजे बायोटिन- फिनॉल रॅडिकल्स आणि एका मिनिटात 9,10 मध्ये प्रथिने लेबलिंग करण्यास अनुमती देते. APEX चा वापर सबसेल्युलर प्रोटीओम, झिल्ली प्रोटीन कॉम्प्लेक्स आणि साइटोसोलिक सिग्नलिंग प्रोटीन कॉम्प्लेक्स 11,12 ओळखण्यासाठी केला जातो. तथापि, पेरोक्साइड्सच्या उच्च सांद्रतेची आवश्यकता रेडॉक्स प्रथिने किंवा मार्गांवर परिणाम करू शकते. सेल्युलर प्रक्रिया.
अशा प्रकारे, सेल्युलर मार्गांमध्ये लक्षणीय व्यत्यय न आणता उच्च अवकाशीय आणि ऐहिक अचूकतेसह अधिक प्रतिक्रियाशील लेबल-त्रिज्या सप्रेशन प्रजाती निर्माण करण्यास सक्षम असलेली नवीन पद्धत विद्यमान पद्धतींमध्ये एक महत्त्वाची जोड असेल. प्रतिक्रियाशील प्रजातींपैकी, सिंगलट ऑक्सिजनने त्याचे लहान आयुष्य आणि मर्यादित प्रसार त्रिज्या (पेशींमध्ये t1/2 <0.6 µs)१३ मुळे आमचे लक्ष वेधून घेतले. प्रतिक्रियाशील प्रजातींपैकी, सिंगलट ऑक्सिजनने त्याचे लहान आयुष्य आणि मर्यादित प्रसार त्रिज्या (पेशींमध्ये t1/2 <0.6 µs)१३ मुळे आमचे लक्ष वेधून घेतले. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного ограниченного , ограниченного и ограниченного. सक्रिय स्वरूपांपैकी, सिंगलट ऑक्सिजनने त्याचे लहान आयुष्य आणि मर्यादित प्रसार त्रिज्या (पेशींमध्ये t1/2 <0.6 µs)१३ मुळे आमचे लक्ष वेधले.在活性物质中,单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0.6 µs）耬. 1/2 < 0.6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни , и ограниченногивкает синглетный кислород. सक्रिय स्वरूपांपैकी, सिंगलट ऑक्सिजन त्याच्या लहान आयुष्यामुळे आणि मर्यादित प्रसार त्रिज्यामुळे (पेशींमध्ये t1/2 <0.6 μs) आपले लक्ष वेधून घेतो.सिंगल ऑक्सिजन यादृच्छिकपणे मेथियोनाइन, टायरोसिन, हिस्टिडाइन आणि ट्रिप्टोफॅनचे ऑक्सिडाइझ करत असल्याचे नोंदवले गेले आहे, ज्यामुळे ते अमाइन किंवा थिओल आधारित प्रोब्स 16,17 ला जोडण्यासाठी ध्रुवीय 14,15 बनते.जरी सिंगल ऑक्सिजनचा वापर सबसेल्युलर कंपार्टमेंट RNA ला लेबल करण्यासाठी केला गेला असला तरी, अंतर्जात POI प्रॉक्सिमिटी मार्कर पुन्हा तयार करण्याच्या धोरणांचा शोध लागलेला नाही.येथे, आम्ही फोटोएक्टिव्हेशन-डिपेंडेंट प्रॉक्सिमिटी लेबलिंग (PDPL) नावाचा एक प्लॅटफॉर्म सादर करतो, जिथे आम्ही miniSOG फोटोसेन्सिटायझरसह POI प्रकाशित करण्यासाठी निळा प्रकाश वापरतो आणि प्रॉक्सिमल अवशेषांचे ऑक्सिडाइझ करण्यासाठी सिंगलट ऑक्सिजन निर्मिती ट्रिगर करतो, त्यानंतर रासायनिक प्रोबमध्ये ऑक्सिडायझ करण्यासाठी अमाइन-युक्त बदल घडवून आणतो. मध्यवर्ती जिवंत पेशी..आम्ही टॅग विशिष्टता वाढवण्यासाठी रासायनिक प्रोबच्या गटाची चाचणी केली आणि ओपन प्रोटिओमिक्स वर्कफ्लो वापरून बदल साइट ओळखल्या.PDPL ची TurboID सह शेजारी-बाय-साइड तुलना PDPL चे अधिक विशिष्ट आणि व्यापक प्रोटीओमिक कव्हरेज दर्शवते.कॅन्सर-संबंधित एपिजेनेटिक रेग्युलेटरी प्रोटीन BRD4 आणि पार्किन्सन्स रोग-संबंधित E3 लिगेस पार्किनसाठी सबसेल्युलर प्रोटीओमच्या ऑर्गेनेल-विशिष्ट मार्कर आणि सामान्य प्रोटीओम ओळखण्यासाठी आम्ही हा दृष्टिकोन लागू केला, ज्याने प्रथिनांच्या ज्ञात आणि अज्ञात नेटवर्कची पुष्टी केली. परस्परसंवाद.मोठ्या प्रोटीन कॉम्प्लेक्समध्ये E3 सब्सट्रेट्स ओळखण्याची PDPL ची क्षमता अप्रत्यक्ष बाइंडरची ओळख आवश्यक असलेल्या परिस्थितीचे प्रतिनिधित्व करते.सर्वव्यापी-प्रोटीसोमद्वारे मध्यस्थी केलेल्या दोन अज्ञात पार्किन सब्सट्रेट्सची पुष्टी केली गेली आहे.
फोटोडायनामिक थेरपी (PDT)19 आणि क्रोमोफोर-असिस्टेड लेसर इनएक्टिव्हेशन (CALI)20, ज्यामध्ये फोटोसेन्सिटायझर्ससह प्रकाश विकिरण सिंगलट ऑक्सिजन तयार करते, लक्ष्य प्रथिने निष्क्रिय करू शकतात किंवा सेल मृत्यू होऊ शकतात.सिंगलट ऑक्सिजन हा एक अत्यंत प्रतिक्रियाशील पदार्थ असल्याने त्याचे सैद्धांतिक प्रसार अंतर सुमारे 70 nm आहे, फोटोसेन्सिटायझरभोवती अवकाशीय मर्यादित ऑक्सिडेशन नियंत्रित केले जाऊ शकते.या संकल्पनेवर आधारित, आम्ही जिवंत पेशींमध्ये प्रोटीन कॉम्प्लेक्सचे जवळचे लेबलिंग साध्य करण्यासाठी सिंगल ऑक्सिजन वापरण्याचे ठरवले.आम्ही चार कार्ये पूर्ण करण्यासाठी एक PDPL केमोप्रोटिओमिक दृष्टीकोन विकसित केला आहे: (1) PL एन्झाइमॅटिक दृष्टिकोनाप्रमाणेच सक्रिय सिंगल ऑक्सिजनची निर्मिती उत्प्रेरित करण्यासाठी;(2) प्रकाश दीक्षा वर वेळ-निराकरण लेबलिंग प्रदान;(३) फेरफार करून (४) पार्श्वभूमी कमी करण्यासाठी अंतर्जात कोफॅक्टर्स (जसे की बायोटिन) वापरणे टाळा किंवा पर्यावरणीय ताणतणावांना सेल एक्सपोजर कमी करण्यासाठी अत्यंत त्रासदायक एक्सोजेनस अभिकर्मक (जसे की पेरोक्साइड) वापरा.
फोटोसेन्सिटायझर्सना लहान आण्विक वजनाचे फ्लोरोफोर्स (उदा. रोझ बेंगल, मिथिलीन ब्लू)२२ आणि अनुवांशिकदृष्ट्या एन्कोड केलेले लहान प्रथिने (उदा. miniSOG, KillerRed) 23 यासह दोन श्रेणींमध्ये विभागले जाऊ शकतात.मॉड्यूलर डिझाइन साध्य करण्यासाठी, आम्ही POI24,25 (आकृती 1a) मध्ये फोटोसेन्सिटायझर (PS) प्रथिने जोडून पहिल्या पिढीचे PDPL प्लॅटफॉर्म विकसित केले.निळ्या प्रकाशाने विकिरण केल्यावर, सिंगलट ऑक्सिजन प्रॉक्सिमल न्यूक्लियोफिलिक अमीनो ऍसिडच्या अवशेषांचे ऑक्सिडाइझ करते, परिणामी एक अंपोलंग पोलॅरिटी होते जी इलेक्ट्रोफिलिक असते आणि पुढे अमाइन प्रोब न्यूक्लियोफाइल्स 16,17 वर प्रतिक्रिया देऊ शकते.क्लिक केमिस्ट्रीला अनुमती देण्यासाठी आणि एलसी/एमएस/एमएस कॅरेक्टरायझेशनसाठी खाली खेचण्यासाठी प्रोबची रचना अल्काइन हँडलने केली आहे.
miniSOG द्वारे मध्यस्थी केलेल्या प्रोटीन कॉम्प्लेक्सच्या लेबलिंगचे योजनाबद्ध चित्रण.निळ्या प्रकाशाच्या संपर्कात आल्यावर, miniSOG-POI व्यक्त करणार्‍या पेशी सिंगलट ऑक्सिजन तयार करतात, जे परस्परसंवादी प्रथिने सुधारतात परंतु नॉन-बाइंडिंग प्रोटीन्समध्ये बदल करतात.फोटोऑक्सिडेशनची इंटरमीडिएट उत्पादने अमाईन केमिकल प्रोबच्या रिले लेबल्सद्वारे कोव्हॅलेंट अॅडक्ट्स तयार करण्यासाठी रोखली जातात.केमिस्ट्री प्रोबवरील अल्काइनिल ग्रुप पुल-डाउन आणि त्यानंतर एलसी-एमएस/एमएस क्वांटिटेशनद्वारे समृद्धीसाठी क्लिक केमिस्ट्रीला परवानगी देतो.b अमाइन प्रोबची रासायनिक रचना 1-4.c प्रोब 1-4 वापरून माइटोकॉन्ड्रियल स्थानिकीकृत मिनीएसओजी-मध्यस्थ प्रोटीओमिक मार्करचे प्रतिनिधी फ्लोरोसेंट जेल विश्लेषण आणि जेल डेंसिटोमेट्रीवर आधारित सापेक्ष परिमाण.निळा प्रकाश वगळता नकारात्मक नियंत्रण प्रयोग वापरून किंवा मिनीएसओजी अभिव्यक्तीशिवाय HEK293T सेल वापरून रासायनिक प्रोबचे सिग्नल-टू-पार्श्वभूमी गुणोत्तराचे मूल्यांकन केले गेले.n = 2 जैविक दृष्ट्या स्वतंत्र नमुने.प्रत्येक बिंदू जैविक प्रतिकृती दर्शवतो.d पीडीपीएलचे प्रातिनिधिक शोध आणि प्रमाणीकरण इष्टतम प्रोब 3 चा वापर करून दर्शविलेल्या पीडीपीएल घटकांच्या उपस्थितीत किंवा अनुपस्थितीत c.n = 3 जैविक दृष्ट्या स्वतंत्र नमुने.प्रत्येक बिंदू जैविक प्रतिकृती दर्शवतो.केंद्ररेषा आणि व्हिस्कर्स सरासरी आणि ± मानक विचलनाचे प्रतिनिधित्व करतात.CBB: कूमासी ब्रिलियंट ब्लू.e दूर-लाल Si-DMA डागांसह सिंगल ऑक्सिजनचे कॉन्फोकल इमेजिंग.स्केल बार: 10 µm.जेल इमेजिंग आणि कॉन्फोकल प्रयोग समान परिणामांसह किमान दोनदा स्वतंत्रपणे पुनरावृत्ती झाले.
आम्‍ही प्रथम प्रौढ फोटोसेन्सिटायझर्स मिनीएसओजी26 आणि किलररेड23 ची क्षमता तपासली, जे HEK293T मध्‍ये स्थिरपणे व्‍यक्‍त केले आहे, प्रोटीओमचे रासायनिक प्रोब (पूरक अंजीर 1a) म्‍हणून प्रोपर्जिलामाइन लेबलिंगमध्‍ये मध्यस्थी करण्‍यासाठी.जेल फ्लूरोसेन्स विश्लेषणाने दर्शविले की संपूर्ण प्रोटीओम लेबलिंग मिनीएसओजी आणि ब्लू लाइट इरॅडिएशन वापरून साध्य केले गेले, तर किलररेडसह कोणतेही दृश्यमान लेबलिंग उत्पादन आढळले नाही.सिग्नल-टू-पार्श्वभूमी गुणोत्तर सुधारण्यासाठी, आम्ही नंतर अॅनिलिन (1 आणि 3), प्रोपिलामाइन (2), किंवा बेंझिलामाइन (4) असलेल्या रासायनिक प्रोबच्या संचाची चाचणी केली.आम्‍ही पाहिले की HEK293T पेशींमध्ये निळ्या प्रकाशाच्‍या तुलनेत स्‍वत:च्‍या पार्श्वभूमीचे संकेत अधिक आहेत, कदाचित अंतर्जात रिबोफ्लेविन फोटोसेन्सिटायझर, फ्लेविन मोनोन्यूक्लियोटाइड (FMN) 27 मुळे. अॅनिलिन-आधारित रासायनिक प्रोब 1 आणि 3 ने अधिक चांगली विशिष्टता दिली, HEK293T स्थिरपणे मायटोकॉन्ड्रियामध्ये miniSOG व्यक्त करते आणि प्रोब 3 साठी सिग्नलमध्ये > 8-पट वाढ दर्शवते, तर RNA-लेबलिंग पद्धती CAP-seq मध्ये वापरलेले प्रोब 2 फक्त ~2.5- प्रदर्शित करते. फोल्ड सिग्नलमध्ये वाढ, शक्यतो RNA आणि प्रथिने (Fig. 1b, c) मधील भिन्न प्रतिक्रियाशीलता प्राधान्यांमुळे. अॅनिलिन-आधारित रासायनिक प्रोब 1 आणि 3 ने अधिक चांगली विशिष्टता दिली, HEK293T स्थिरपणे मायटोकॉन्ड्रियामध्ये miniSOG व्यक्त करते आणि प्रोब 3 साठी सिग्नलमध्ये > 8-पट वाढ दर्शवते, तर RNA-लेबलिंग पद्धती CAP-seq मध्ये वापरलेले प्रोब 2 फक्त ~2.5- प्रदर्शित करते. फोल्ड सिग्नलमध्ये वाढ, शक्यतो RNA आणि प्रथिने (Fig. 1b, c) मधील भिन्न प्रतिक्रियाशीलता प्राधान्यांमुळे.अॅनिलिन-आधारित रासायनिक प्रोब 1 आणि 3 ने अधिक चांगली विशिष्टता दर्शविली: HEK293T, जे मायटोकॉन्ड्रियामध्ये स्थिरपणे miniSOG व्यक्त करते, प्रोब 3 साठी सिग्नलमध्ये 8-पट वाढ दर्शवते, तर प्रोब 2, CAP-seq RNA लेबलिंग पद्धतीमध्ये वापरले जाते, फक्त RNA आणि प्रथिने (Fig. 1b, c) मधील भिन्न प्रतिक्रियाशीलता प्राधान्यांमुळे ~2.5-पट सिग्नल वाढ दर्शवते.. 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b,c）.. - 倍信号增加, 可能是由于RNAअॅनिलिन-आधारित रासायनिक प्रोब 1 आणि 3 मध्ये अधिक चांगली विशिष्टता होती, HEK293T ने मायटोकॉन्ड्रियामध्ये स्थिरपणे miniSOG व्यक्त केले आणि प्रोब 3 ने सिग्नलमध्ये 8-पट वाढ केली, तर CAP-seq RNA लेबलिंग पद्धतीसाठी प्रोब 2 ने केवळ ~ 2.5-पट वाढ दर्शविली.सिग्नलमध्ये, कदाचित आरएनए आणि प्रथिने यांच्यातील भिन्न प्रतिक्रिया प्राधान्यांमुळे (चित्र 1b, c).याव्यतिरिक्त, प्रोब 3 आयसोमर्स आणि हायड्रॅझिन प्रोब (प्रोब 5, 6, 7) तपासले गेले, जे प्रोब 3 (पूरक अंजीर 1b,c) च्या ऑप्टिमायझेशनची पुष्टी करते.त्याचप्रमाणे, इन-जेल फ्लूरोसेन्स विश्लेषणाने इतर इष्टतम प्रायोगिक मापदंड उघड केले: विकिरण तरंगलांबी (460 एनएम), रासायनिक तपासणी एकाग्रता (1 मिमी), आणि विकिरण वेळ (20 मिनिटे) (पूरक चित्र 2a–c).PDPL प्रोटोकॉलमधील कोणताही घटक किंवा पायरी वगळल्याने पार्श्वभूमीवर लक्षणीय सिग्नल उलटले (Fig. 1d).विशेष म्हणजे, सोडियम अॅझाइड किंवा ट्रोलॉक्सच्या उपस्थितीत प्रोटीन लेबलिंग लक्षणीयरीत्या कमी होते, जे सिंगल ऑक्सिजन शमन करण्यासाठी ओळखले जातात.D2O ची उपस्थिती, जी सिंगल ऑक्सिजन स्थिर करण्यासाठी ओळखली जाते, लेबलिंग सिग्नल वाढवते.लेबलिंगमध्ये इतर प्रतिक्रियाशील ऑक्सिजन प्रजातींचे योगदान तपासण्यासाठी, मॅनिटोल आणि व्हिटॅमिन सी अनुक्रमे 18, 29, हायड्रॉक्सिल आणि सुपरऑक्साइड रॅडिकल स्कॅव्हेंजर स्थापित करण्यासाठी जोडले गेले, परंतु ते लेबलिंग कमी करणारे आढळले नाहीत.H2O2 जोडणे, परंतु प्रदीपन नाही, लेबलिंगमध्ये परिणाम झाला नाही (पूरक चित्र 3a).Si-DMA प्रोबसह फ्लूरोसेन्स सिंगल ऑक्सिजन इमेजिंगने HEK293T-miniSOG वायरमध्ये सिंगल ऑक्सिजनच्या उपस्थितीची पुष्टी केली, परंतु मूळ HEK293T वायरमध्ये नाही.याव्यतिरिक्त, माइटोसॉक्स रेड प्रदीपनानंतर सुपरऑक्साइड उत्पादन शोधू शकले नाही (चित्र 1e आणि पूरक आकृती 3b) 30. हे डेटा जोरदारपणे सूचित करतात की सिंगल ऑक्सिजन ही त्यानंतरच्या प्रोटीओमिक लेबलिंगसाठी जबाबदार मुख्य प्रतिक्रियाशील ऑक्सिजन प्रजाती आहे.पीडीपीएलच्या सायटोटॉक्सिसिटीचे मूल्यमापन निळ्या प्रकाशाच्या विकिरण आणि रासायनिक तपासणीसह केले गेले आणि कोणतीही लक्षणीय सायटोटॉक्सिसिटी आढळली नाही (पूरक चित्र 4a).
लेबलिंग मेकॅनिझमचा अभ्यास करण्यासाठी आणि LC-MS/MS वापरून प्रोटीन कॉम्प्लेक्सची प्रोटीओमिक ओळख सक्षम करण्यासाठी, आम्हाला प्रथम कोणते अमीनो ऍसिड सुधारित केले आहेत आणि प्रोब लेबल्सचे डेल्टा मास हे निर्धारित करणे आवश्यक आहे.मेथिओनाइन, हिस्टिडाइन, ट्रिप्टोफॅन आणि टायरोसिन हे सिंगल ऑक्सिजन 14,15 द्वारे सुधारित केले गेले आहेत.आम्ही MSFragger32 वर आधारित FragPipe कंप्युटिंग प्लॅटफॉर्मद्वारे प्रदान केलेल्या निःपक्षपाती मुक्त शोधासह TOP-ABPP31 कार्यप्रवाह एकत्रित करतो.सिंगल ऑक्सिजन मॉडिफिकेशन आणि केमिकल प्रोब लेबलिंगनंतर, क्लीव्हेबल लिंकर असलेले बायोटिन रिडक्शन लेबल वापरून क्लिक केमिस्ट्री केली गेली, त्यानंतर न्यूट्राव्हिडिन स्ट्रेचिंग आणि ट्रिप्सिन डायजेशन.सुधारित पेप्टाइड, तरीही राळला बांधलेले, LC-MS/MS विश्लेषणासाठी फोटोक्लीव्ह केले गेले (आकृती 2a आणि पूरक डेटा 1).प्रोटीओममध्ये ५० पेक्षा जास्त पेप्टाइड मॅप (PSM) मॅच सूचीबद्ध केलेल्या (चित्र 2b) मध्ये मोठ्या प्रमाणात बदल झाले.आश्चर्याची गोष्ट म्हणजे, आम्ही फक्त हिस्टिडाइनमध्ये बदल पाहिला, कदाचित इतर अमीनो ऍसिडच्या तुलनेत अॅनिलिन प्रोबच्या दिशेने ऑक्सिडाइज्ड हिस्टिडाइनच्या उच्च प्रतिक्रियामुळे.सिंगल ऑक्सिजनद्वारे हिस्टिडाइन ऑक्सिडेशनच्या प्रकाशित यंत्रणेनुसार, 21,33 +229 Da ची प्रस्तावित डेल्टा-मास रचना दोन ऑक्सिडेशननंतर 2-ऑक्सो-हिस्टिडाइनसह प्रोब 3 च्या अॅडक्टशी संबंधित आहे, तर +247 Da हे हायड्रोलिसिस उत्पादन आहे. of +229 Da (पूरक आकृती 5).MS2 स्पेक्ट्रमच्या मूल्यमापनाने सुधारित फ्रॅगमेंट आयन (y आणि b) (Fig. 2c) ओळखण्यासह बहुतेक y आणि b आयनांच्या ओळखीची उच्च विश्वासार्हता दर्शविली.पीडीपीएल-सुधारित हिस्टिडाइन्सच्या स्थानिक क्रमाच्या संदर्भ विश्लेषणाने ±1 पोझिशन्स (पूरक अंजीर 4b) वर लहान हायड्रोफोबिक अवशेषांसाठी मध्यम स्वरूपाचे प्राधान्य प्रकट केले.सरासरी, प्रति प्रोटीन 1.4 हिस्टिडाइन ओळखले गेले, आणि या मार्करची ठिकाणे सॉल्व्हेंट ऍक्सेसिबल पृष्ठभाग क्षेत्र (SASA) आणि संबंधित सॉल्व्हेंट उपलब्धता (RSA) विश्लेषण (पूरक अंजीर 4c,d) द्वारे निर्धारित केली गेली.
MSFragger द्वारे समर्थित FragPipe संगणकीय प्लॅटफॉर्म वापरून अवशिष्ट निवडकतेचा अभ्यास करण्यासाठी एक निष्पक्ष कार्यप्रवाह.स्ट्रेप्टाव्हिडिन रेझिनपासून सुधारित पेप्टाइड्सचे फोटोक्लेव्हेज करण्यास परवानगी देण्यासाठी क्लिक केमिस्ट्रीमध्ये क्लीव्हेबल लिंकर्सचा वापर केला जातो.असंख्य बदल, तसेच संबंधित अवशेष ओळखण्यासाठी खुला शोध सुरू करण्यात आला.b संपूर्ण प्रोटीओममध्ये होणार्‍या बदलांचे वस्तुमान नियुक्त करा.पेप्टाइड मॅपिंग PSM.c MS2 हिस्टिडाइन साइट्सचे स्पेक्ट्रल भाष्य प्रोब 3 सह सुधारित केले. प्रातिनिधिक उदाहरण म्हणून, प्रोब 3 सह सहसंयोजक प्रतिक्रियेने सुधारित अमीनो ऍसिडमध्ये +229.0938 Da जोडले.d उत्परिवर्तन परख PDPL मार्करसाठी चाचणी करण्यासाठी वापरली जाते.PRDX3 (H155A, H225A) आणि PRDX1 (H10A, H81A, H169A) हे अँटी-फ्लॅग डिटेक्शनसाठी जंगली-प्रकारच्या प्लाझमिड्सने बदलले गेले.e प्रोब 3 च्या उपस्थितीत सिंथेटिक पेप्टाइडला शुद्ध miniSOG सह प्रतिक्रिया दिली गेली आणि Δm +247 आणि +229 सह संबंधित उत्पादने LC-MS स्पेक्ट्रममध्ये नोंदवली गेली.f miniSOG-6xHis-tag आणि anti-6xHis अँटीबॉडीसह मॉडेल केलेले इन विट्रो प्रोटीन-टू-प्रोटीन परस्परसंवाद.प्रतिजैविक (स्ट्रेप्टाव्हिडिन-एचआरपी) आणि प्रकाशाच्या संपर्कात येण्याच्या वेळेनुसार प्रोब 3 ने लेबल केलेल्या miniSOG-6xHis/anti-6xHis अँटीबॉडी कॉम्प्लेक्सचे अँटी-माउस वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण.वैयक्तिक प्रथिनांची लेबले संबंधित आण्विक वजनामध्ये व्यक्त केली जातात: एलसी अँटीबॉडी लाइट चेन, एचसी अँटीबॉडी हेवी चेन.समान परिणामांसह हे प्रयोग स्वतंत्रपणे किमान दोनदा पुनरावृत्ती झाले.
लेबलिंग साइटच्या जैवरासायनिक पडताळणीसाठी, मास स्पेक्ट्रोमेट्रीद्वारे ओळखले जाणारे PRDX3 आणि PRDX1 हिस्टिडाइनपासून अॅलनाइनमध्ये बदलले गेले आणि ट्रान्सफेक्शन अॅसेजमधील जंगली प्रकाराशी तुलना केली गेली.PDPL परिणामांनी असे दर्शवले की उत्परिवर्तनाने लेबलिंग लक्षणीयरीत्या कमी केली (चित्र 2d).दरम्यान, खुल्या शोधात ओळखल्या गेलेल्या पेप्टाइड अनुक्रमांचे संश्लेषण केले गेले आणि प्रोब 3 आणि निळ्या प्रकाशाच्या उपस्थितीत शुद्ध miniSOG सह विट्रोमध्ये प्रतिक्रिया दिली, LC-MS द्वारे शोधल्यावर +247 आणि +229 Da च्या वस्तुमान शिफ्टसह उत्पादने मिळविली (चित्र 2e).).miniSOG फोटोअॅक्टिव्हेशनच्या प्रतिसादात प्रॉक्सिमल प्रथिनांना विट्रोमध्ये लेबल केले जाऊ शकते की नाही हे तपासण्यासाठी, आम्ही miniSOG-6xHis प्रोटीन आणि विट्रोमधील अँटी-हिज मोनोक्लोनल अँटीबॉडी (आकृती 2f) यांच्यातील परस्परसंवादाद्वारे एक कृत्रिम समीपता परख तयार केली आहे.या परीक्षणात, आम्हाला miniSOG सह अँटीबॉडी हेवी आणि लाइट चेनचे प्रॉक्सिमल लेबलिंग अपेक्षित आहे.खरं तर, अँटी-माऊस (अँटी-6xHis-लेबल केलेल्या अँटीबॉडीच्या जड आणि हलक्या साखळ्या ओळखणे) आणि स्ट्रेप्टाव्हिडिन वेस्टर्न ब्लॉट्सने जड आणि हलक्या साखळ्यांचे मजबूत बायोटिनिलेशन दर्शविले.विशेष म्हणजे, 6xHis टॅग आणि हलक्या आणि जड साखळ्यांमधील क्रॉस-लिंकमुळे miniSOG ऑटोबायोटिनायलेशन आमच्या लक्षात आले, जे लाइसिन आणि 2-ऑक्सो-हिस्टिडाइन प्रॉक्सिमल प्रतिसादामधील पूर्वी वर्णन केलेल्या अंतराशी संबंधित असू शकते.शेवटी, आम्ही असा निष्कर्ष काढतो की PDPL हिस्टिडाइन समीप अवलंबित पद्धतीने बदलते.
इन सिटू लेबलिंगची विशिष्टता तपासण्यासाठी सबसेल्युलर प्रोटीओमचे वैशिष्ट्य बनवणे हे आमचे पुढील ध्येय होते.म्हणून, आम्ही स्थिरपणे न्यूक्लियस, माइटोकॉन्ड्रियल मॅट्रिक्स, किंवा HEK293T पेशींच्या बाह्य ER झिल्लीमध्ये miniSOG व्यक्त केले (Fig. 3a).जेल फ्लोरोसेन्स विश्लेषणाने तीन सबसेल्युलर स्थानांवर विपुल प्रमाणात लेबल केलेले बँड तसेच विविध लेबलिंग पॅटर्न (चित्र 3b) प्रकट केले.फ्लोरोसेन्स इमेजिंग विश्लेषणाने पीडीपीएलची उच्च विशिष्टता दर्शविली (चित्र 3c).PDPL वर्कफ्लोमध्ये फ्लोरोसेन्स मायक्रोस्कोपी वापरून सबसेल्युलर प्रोटीओम्सचे वर्णन करण्यासाठी रोडामाइन रंगांसह क्लिक प्रतिक्रिया आल्या आणि PDPL सिग्नल्स DAPI, माइटोकॉन्ड्रियल ट्रॅकर्स किंवा ER ट्रॅकर्ससह एकत्रित केले गेले, ज्यामुळे PDPL च्या उच्च निष्ठेची पुष्टी होते.तीन ऑर्गेनेल स्थानांसाठी, एव्हिडिन वेस्टर्न ब्लॉट वापरून PDPL ची TurboID शी शेजारी-बाय-साइड तुलना दर्शविते की PDPL ला त्यांच्या संबंधित नियंत्रणांच्या तुलनेत अधिक विशिष्टपणे लेबल केले गेले होते.पीडीपीएल परिस्थितीत, अधिक लेबल केलेले बँड दिसू लागले, जे अधिक पीडीपीएल-लेबल प्रथिने दर्शवितात (पूरक चित्र 6a-d).
मिनीएसओजी-मध्यस्थ ऑर्गेनेल-विशिष्ट प्रोटीओम लेबलिंगचे योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व.miniSOG मानवी COX4 (mito-miniSOG) च्या N-टर्मिनल 23 अमीनो ऍसिडमध्ये फ्यूजनद्वारे माइटोकॉन्ड्रियल मॅट्रिक्स, H2B (न्यूक्लियस-मिनीएसओजी) च्या फ्यूजनद्वारे न्यूक्लियस आणि ER झिल्लीच्या साइटोप्लाज्मिक बाजूद्वारे Sec61β (ER-miniSOG) ला लक्ष्य करते. ).संकेतांमध्ये जेल इमेजिंग, कॉन्फोकल इमेजिंग आणि मास स्पेक्ट्रोमेट्री यांचा समावेश होतो.b तीन ऑर्गेनेल-विशिष्ट PDPL प्रोफाइलच्या प्रतिनिधी जेल प्रतिमा.CBB Coomassie ब्रिलियंट ब्लू.c HEK293T पेशींच्या प्रतिनिधी confocal प्रतिमा V5 (लाल).माइटोकॉन्ड्रिया आणि ईआर (हिरव्या) साठी सबसेल्युलर मार्कर वापरले जातात.PDPL वर्कफ्लोमध्ये Cy3-azide क्लिक केमिस्ट्रीचा वापर करून miniSOG (पिवळा) लेबल केलेले सबसेल्युलर प्रोटीओम्स शोधणे समाविष्ट आहे.स्केल बार: 10 µm.d ज्वालामुखीय भूखंड पीडीपीएल-टॅग केलेल्या प्रोटीओम्सचे विविध ऑर्गेनेल्समध्ये लेबल नसलेल्या परिमाणीकरणाद्वारे परिमाण केले जाते (n = 3 स्वतंत्र जैविक प्रयोग).ज्वालामुखीच्या भूखंडांवर दोन-पुच्छ विद्यार्थ्यांची टी-चाचणी वापरली गेली.HEK293T जंगली प्रकार नकारात्मक नियंत्रण म्हणून वापरला गेला. लक्षणीय बदललेली प्रथिने लाल रंगात हायलाइट केली जातात (p <0.05 आणि > 2-पट आयन तीव्रता फरक). लक्षणीय बदललेली प्रथिने लाल रंगात हायलाइट केली जातात (p <0.05 आणि > 2-पट आयन तीव्रता फरक). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). लक्षणीय बदललेली प्रथिने लाल रंगात ठळक केली जातात (p <0.05 आणि आयन तीव्रतेमध्ये >2-पट फरक).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05和>2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). लक्षणीय बदललेली प्रथिने लाल रंगात ठळक केली जातात (p <0.05 आणि > आयनिक सामर्थ्यात 2-पट फरक).संबंधित प्रथिने HEK293T-miniSOG साठी महत्वाचे आहेत परंतु HEK293T साठी महत्वाचे नाहीत हिरव्या रंगात दर्शविले आहेत.e प्रयोगांमधून प्रोटीओमिक डेटासेटच्या विशिष्टतेचे विश्लेषण डी.प्रत्येक ऑर्गेनेल (लाल आणि हिरवे ठिपके) मध्ये सांख्यिकीयदृष्ट्या लक्षणीय प्रोटीनची एकूण संख्या शीर्षस्थानी चिन्हांकित केली जाते.हिस्टोग्राम्स MitoCarta 3.0, GO विश्लेषण आणि A. Ting et al वर आधारित ऑर्गेनेल्समध्ये स्थानिकीकृत प्रथिने दर्शवतात.लोकमाइटोकॉन्ड्रिया, न्यूक्ली आणि ER साठी स्वतंत्र डेटासेट.समान परिणामांसह हे प्रयोग स्वतंत्रपणे किमान दोनदा पुनरावृत्ती झाले.कच्चा डेटा रॉ डेटा फाइल्सच्या स्वरूपात प्रदान केला जातो.
जेल आणि इमेजिंग परिणामांद्वारे प्रोत्साहित केले गेले, प्रत्येक ऑर्गेनेल (पूरक डेटा 2) मध्ये ओळखल्या जाणार्‍या प्रोटीओमचे प्रमाण निश्चित करण्यासाठी लेबल-फ्री क्वांटिफिकेशन वापरले गेले.ट्रान्सफेक्टेड HEK293T पार्श्वभूमी मार्कर वजा करण्यासाठी नकारात्मक नियंत्रण म्हणून वापरले गेले. ज्वालामुखी प्लॉट विश्लेषणाने लक्षणीयरीत्या समृद्ध प्रथिने (p <0.05 आणि >2-पट आयन तीव्रता) तसेच सिंगलटन प्रथिने प्रदर्शित केली जी फक्त मिनीएसओजी-एक्सप्रेसिंग लाइन्समध्ये असतात (चित्र 3d लाल आणि हिरवे ठिपके). ज्वालामुखी प्लॉट विश्लेषणाने लक्षणीयरीत्या समृद्ध प्रथिने (p <0.05 आणि >2-पट आयन तीव्रता) तसेच सिंगलटन प्रथिने प्रदर्शित केली जी फक्त मिनीएसओजी-एक्सप्रेसिंग लाइन्समध्ये असतात (चित्र 3d लाल आणि हिरवे ठिपके). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). ज्वालामुखी प्लॉट विश्लेषणाने लक्षणीयरीत्या समृद्ध प्रथिने (p<0.05 आणि >2-fold आयन तीव्रता) तसेच एकल प्रथिने दर्शविली जी फक्त miniSOG-व्यक्त रेषांमध्ये असतात (चित्र 3d, लाल आणि हिरवे ठिपके)... Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). ज्वालामुखी प्लॉट विश्लेषणाने लक्षणीयरीत्या समृद्ध प्रथिने (p<0.05 आणि >2x ionic स्ट्रेंथ) तसेच एकल प्रथिने केवळ miniSOG अभिव्यक्ती ओळीत (Fig. 3d मधील लाल आणि हिरवे ठिपके) आढळून आले.या डेटाचे संयोजन करून, आम्ही अनुक्रमे 1364, 461, आणि 911 सांख्यिकीयदृष्ट्या महत्त्वपूर्ण परमाणु, माइटोकॉन्ड्रियल आणि ER बाह्य झिल्ली प्रथिने ओळखले.ऑर्गेनेल-स्थानिकीकृत PDPL च्या अचूकतेचे विश्लेषण करण्यासाठी, आम्ही MitoCarta 3.0, Gene Ontology (GO) विश्लेषण आणि A. Ting et al वापरले.73.4, 78.5 आणि 73.0% (चित्र 3e) च्या अचूकतेशी संबंधित आढळलेल्या प्रथिनांच्या ऑर्गेनेल विशिष्टतेची चाचणी करण्यासाठी मायटोकॉन्ड्रिया, न्यूक्लियस आणि ER साठी डेटा सेट8 वापरला गेला.PDPL ची विशिष्टता पुष्टी करते की PDPL हे ऑर्गेनेल-विशिष्ट प्रोटीओम्स ओळखण्यासाठी एक आदर्श साधन आहे.विशेष म्हणजे, ओळखल्या गेलेल्या माइटोकॉन्ड्रियल प्रथिनांच्या सबमिटोकॉन्ड्रियल विश्लेषणातून असे दिसून आले की अडकलेले प्रोटीओम प्रामुख्याने मॅट्रिक्स आणि आतील पडद्यामध्ये (अनुक्रमे 226 आणि 106) वितरीत केले गेले होते, ओळखलेल्या माइटोकॉन्ड्रियल प्रथिनांच्या एकूण संख्येपैकी 91.7% (362) होते.PDPL च्या उच्च पातळीची अतिरिक्त पुष्टी केली गेली (पूरक चित्र 7a).त्याचप्रमाणे, सबन्यूक्लियर विश्लेषणाने असे दर्शवले की पकडलेले प्रोटीओम मुख्यत्वे न्यूक्लियस, न्यूक्लियोप्लाझम आणि न्यूक्लियोलस (पूरक अंजीर 7b) मध्ये वितरित केले गेले.न्यूक्लियर लोकॅलायझेशन सिग्नल पेप्टाइड (3xNLS) सह आण्विक प्रोटिओमिक विश्लेषणाने H2B रचना (पूरक चित्र 7c–h) सारखीच अचूकता दर्शविली.PDPL मार्करची विशिष्टता निश्चित करण्यासाठी, न्यूक्लियर लॅमिनिन A अधिक सुस्पष्टपणे स्थानिकीकृत POI7 ट्रॅप म्हणून निवडले गेले.PDPL ने 36 लक्षणीय समृद्ध प्रथिने ओळखली, त्यापैकी 12 प्रथिने (30.0% लॅमिन ए सह) स्ट्रिंग डेटाबेसद्वारे भाष्य केलेले लॅमिन ए परस्परसंवादी प्रथिने आहेत, 28 पैकी 28. , 22.9 BioID पद्धती (122 प्रथिने) पेक्षा जास्त टक्केवारीसह. %) 7. आमच्या पद्धतीने कमी प्रथिने ओळखले, शक्यतो मर्यादित लेबलिंग क्षेत्रांमुळे, जे अधिक सक्रिय सिंगल ऑक्सिजनमुळे शक्य झाले.GO विश्लेषणाने दर्शविले की ओळखले जाणारे प्रथिने मुख्यत्वे न्यूक्लियोप्लाझम (26), न्यूक्लियर मेम्ब्रेन (10), न्यूक्लियर मेम्ब्रेन (9) आणि न्यूक्लियर पोर्स (5) मध्ये आहेत.एकत्रितपणे, हे अणु-स्थानिकीकृत प्रथिने समृद्ध प्रथिनांपैकी 80% आहेत, पुढे PDPL (पूरक चित्र 8a–d) ची विशिष्टता दर्शवितात.
ऑर्गेनेल्समध्ये प्रॉक्सिमिटी मार्किंग करण्यासाठी PDPL ची क्षमता स्थापित केल्यानंतर, आम्ही नंतर POI बंधनकारक भागीदारांचे विश्लेषण करण्यासाठी PDPL चा वापर केला जाऊ शकतो का याची चाचणी केली.विशेषतः, आम्ही सायटोसोलिक प्रथिनांचे PDPL विश्लेषण परिभाषित करण्याचा प्रयत्न केला, जे त्यांच्या उच्च गतिमान स्वभावामुळे त्यांच्या झिल्ली-स्थानिक समकक्षांपेक्षा अधिक कठीण लक्ष्य मानले जातात.ब्रोमोडोमेन आणि एक्स्ट्राटरमिनल (BET) प्रोटीन BRD4 ने विविध रोगांमध्‍ये प्रमुख भूमिकेसाठी आमचे लक्ष वेधले आहे 35, 36.BRD4 द्वारे तयार केलेले कॉम्प्लेक्स हे ट्रान्सक्रिप्शनल कोएक्टिवेटर आणि एक महत्त्वाचे उपचारात्मक लक्ष्य आहे.c-myc आणि Wnt5a ट्रान्सक्रिप्शन घटकांच्या अभिव्यक्तीचे नियमन करून, BRD4 तीव्र मायलॉइड ल्यूकेमिया (AML), मल्टिपल मायलोमा, बुर्किट लिम्फोमा, कोलन कर्करोग आणि दाहक रोग 37,38 चे मुख्य निर्धारक मानले जाते.याव्यतिरिक्त, काही व्हायरस विषाणू आणि सेल्युलर ट्रान्सक्रिप्शनचे नियमन करण्यासाठी BRD4 ला लक्ष्य करतात, जसे की पॅपिलोमाव्हायरस, HIV आणि SARS-CoV-236,39.
PDPL वापरून BRD4 परस्परसंवाद मॅप करण्यासाठी, आम्ही miniSOG ला BRD4 च्या लहान N- किंवा C-टर्मिनल आयसोफॉर्मसह एकत्र केले.प्रोटीओमिक परिणामांनी दोन रचनांमधील उच्च प्रमाणात ओव्हरलॅप उघड केले (पूरक चित्र 9a).miniSOG-H2B सह ओळखले जाणारे आण्विक प्रोटीओम BRD4 (पूरक अंजीर 9b) शी संवाद साधणाऱ्या 77.6% प्रथिने व्यापते.त्यानंतर, मार्कर त्रिज्या (चित्र 4a आणि पूरक डेटा 3) समायोजित करण्यासाठी प्रकाशाच्या वेगवेगळ्या वेळा (2, 5, 10, 20 मिनिटे) वापरल्या गेल्या.आम्ही असा निष्कर्ष काढतो की लहान फोटोपीरियड्समध्ये, PDPL प्रामुख्याने थेट बंधनकारक भागीदारांना लेबल करेल, तर दीर्घ कालावधीमध्ये लहान फोटोएक्टिव्हेशन कालावधीत ओळखल्या जाणार्‍या प्रथिने तसेच लेबलिंग कॉम्प्लेक्समधील अप्रत्यक्ष लक्ष्यांचा समावेश असेल.खरं तर, आम्हाला समीप टाइम पॉइंट्स (2 आणि 5 मिनिटांसाठी 84.6%; 5 आणि 10 मिनिटांसाठी 87.7%; 10 आणि 20 मिनिटांसाठी 98.7%) (चित्र 4b आणि पूरक आकृती. 9c) दरम्यान मजबूत ओव्हरलॅप आढळले.सर्व प्रायोगिक गटांमध्ये, आम्हाला केवळ BRD4 स्व-लेबलिंगच नाही, तर स्ट्रिंग डेटाबेसमध्ये भाष्य केलेले MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A आणि HMGB1 सारखी अनेक ज्ञात लक्ष्ये आढळली.या लक्ष्यांची आयनिक ताकद एक्सपोजर वेळेच्या प्रमाणात आहे (चित्र 4c आणि पूरक अंजीर. 9d).2-मिनिटांच्या गटामध्ये ओळखल्या गेलेल्या प्रथिनांच्या GO विश्लेषणात असे दिसून आले की ओळखले जाणारे प्रथिने न्यूक्लियसमध्ये स्थानिकीकृत होते आणि क्रोमॅटिन रीमॉडेलिंग आणि आरएनए पॉलिमरेज फंक्शनमध्ये सामील होते.BRD4 फंक्शन (Fig. 4d) शी सुसंगत, प्रथिनांचे आण्विक कार्य क्रोमॅटिन बंधनकारक किंवा ट्रान्सक्रिप्शनल कोएक्टिव्हेशनमध्ये समृद्ध होते.स्ट्रिंग डेटाबेस-सक्षम प्रथिने परस्परसंवाद विश्लेषणाने BRD4 आणि HDAC कुटुंबातील परस्परसंवाद संकुल जसे की SIN3A, NCOR2, BCOR, आणि SAP130 (Fig. 4e आणि पूरक Fig. 9e) यांच्यातील अप्रत्यक्ष परस्परसंवादाचा पहिला स्तर उघड केला आहे, BRD4 आणि HDAC बाइंडिंग ऍसिटिलेट त्याच्याशी सुसंगत आहे. ..याव्यतिरिक्त, Sin3A, NSUN2, Fus आणि SFPQ सह LC-MS/MS द्वारे ओळखले जाणारे प्रतिनिधी लक्ष्य, वेस्टर्न ब्लॉटिंग (चित्र 4f) द्वारे पुष्टी केली गेली.अलीकडे, BRD4 चे लहान आयसोफॉर्म लिक्विड-लिक्विड फेज सेपरेशन (LLPS) गुणधर्मांसह केंद्रक तयार करत असल्याचे नोंदवले गेले आहे.आरएनए बंधनकारक प्रथिने Fus आणि SFPQ विविध सेल्युलर प्रक्रियांच्या LLPS मध्ये मध्यस्थी करतात आणि त्यांची येथे नोंद न केलेले BRD4 बंधनकारक प्रथिने म्हणून ओळखले जाते.BRD4 आणि SFPQ मधील परस्परसंवादाची पुष्टी को-इम्युनोप्रेसिपीटेशन (को-आयपी) प्रयोगांद्वारे (आकृती 4g), BRD4-मध्यस्थ लिक्विड-लिक्विड फेज सेपरेशनसाठी आणखी एक यंत्रणा सुचवते जी पुढील तपासणीस पात्र आहे.एकत्रितपणे, हे परिणाम सूचित करतात की PDPL हे ज्ञात BRD4 परस्परसंवादी तसेच अज्ञात बंधनकारक प्रथिने ओळखण्यासाठी एक आदर्श व्यासपीठ आहे.
miniSOG-मध्यस्थ BRD4 प्रॉक्सिमिटी मार्किंगचे योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व, एक्सपोजर वेळा: 2, 5, 10, आणि 20 मिनिटे.b वेगवेगळ्या प्रदीपन वेळी ओळखल्या जाणार्‍या प्रथिनांचे ओव्हरलॅप.HEK293T-miniSOG-BRD4 मध्ये ओळखले जाणारे प्रथिने संवर्धन हे जंगली-प्रकार HEK293T च्या तुलनेत सांख्यिकीयदृष्ट्या महत्त्वपूर्ण होते.c निर्दिष्ट एक्सपोजर वेळेत लेबल नसलेले प्रतिनिधी ज्ञात BRD4-बाइंडिंग प्रथिने परिमाण करताना आयन तीव्रता.n = 3 जैविक दृष्ट्या स्वतंत्र नमुने.डेटा सरासरी ± मानक विचलन म्हणून सादर केला जातो.d 2-मिनिटांच्या गटामध्ये ओळखल्या गेलेल्या प्रथिनांचे जीन ऑन्टोलॉजिकल विश्लेषण (GO).पहिल्या दहा GO अटी सूचीबद्ध आहेत.GO टर्म श्रेणीनुसार बुडबुडे रंगीत असतात आणि बबलचा आकार प्रत्येक टर्ममध्ये आढळणाऱ्या प्रथिनांच्या संख्येच्या प्रमाणात असतो.ई BRD4 शी संवाद साधणाऱ्या प्रथिनांचे स्ट्रिंग विश्लेषण.पिवळी वर्तुळे थेट गोंद असतात आणि राखाडी वर्तुळे अप्रत्यक्ष गोंदाची पहिली थर असतात.लाल रेषा प्रायोगिकरित्या निर्धारित परस्परसंवाद दर्शवतात आणि निळ्या रेषा अंदाजित परस्परसंवाद दर्शवतात.f LC-MS/MS मध्ये ओळखले जाणारे प्रतिनिधी BRD4 बंधनकारक लक्ष्य वेस्टर्न ब्लॉटिंगद्वारे सत्यापित केले गेले.g सह-इम्युनोप्रीसिपिटेशन प्रयोग SFPQ आणि BRD4 यांच्यातील परस्परसंवादाची पुष्टी करतात.समान परिणामांसह हे प्रयोग स्वतंत्रपणे किमान दोनदा पुनरावृत्ती झाले.कच्चा डेटा रॉ डेटा फाइल्सच्या स्वरूपात प्रदान केला जातो.
नोंदणी न केलेले POI-संबंधित लक्ष्य ओळखण्याव्यतिरिक्त, आम्ही असे गृहित धरतो की PDPL हे एन्झाइम्ससाठी सब्सट्रेट्स ओळखण्यासाठी योग्य असेल, ज्यासाठी मोठ्या कॉम्प्लेक्समध्ये अप्रत्यक्ष बंधनकारक प्रथिनांचे वैशिष्ट्यीकरण आवश्यक असेल.पार्किन (PARK2 द्वारे एन्कोड केलेले) एक E3 ligase आहे आणि पार्किनमधील उत्परिवर्तन ऑटोसोमल रेक्सेसिव्ह किशोर पार्किन्सन रोग (AR-JP)42 साठी कारणीभूत आहेत.याव्यतिरिक्त, पार्किनचे वर्णन मिटोफॅजी (माइटोकॉन्ड्रियल ऑटोफॅजी) आणि प्रतिक्रियाशील ऑक्सिजन प्रजाती काढून टाकण्यासाठी आवश्यक आहे.तथापि, जरी अनेक पार्किन सब्सट्रेट्स ओळखले गेले असले तरी, या रोगामध्ये पार्किनची भूमिका अस्पष्ट राहिली आहे.त्याच्या अनोळखी सब्सट्रेट्सवर भाष्य करण्यासाठी, पार्किनच्या N- किंवा C-टर्मिनसमध्ये miniSOG जोडून PDPL ची चाचणी केली गेली.PINK1-पार्किन मार्गाद्वारे पार्किन सक्रिय करण्यासाठी पेशींवर कार्बोनिल सायनाइड प्रोटॉन ट्रान्सपोर्टर एम-क्लोरोफेनिलहायड्राझोन (CCCP) उपचार केले गेले.आमच्या BRD4 PDPL परिणामांच्या तुलनेत, पार्किन एन-टर्मिनस फ्यूजनने लक्ष्यित प्रथिनांचा एक मोठा संच प्रकट केला, जरी त्यात C-टर्मिनसचा मोठा भाग (210 पैकी 177) समाविष्ट आहे (आकृती 5a,b आणि पूरक डेटा 4).परिणाम अहवालांशी सुसंगत आहे की N-टर्मिनल टॅग पार्किन44 ला अनियंत्रितपणे सक्रिय करू शकतात.आश्चर्याची गोष्ट म्हणजे, आमच्या डेटामध्ये Parkin43 साठी प्रकाशित AP-MS परिणामांसह केवळ 18 आच्छादित प्रथिने होती, बहुधा सेल लाइन्स आणि प्रोटीओमिक्स वर्कफ्लोमधील फरकांमुळे.चार ज्ञात प्रथिने व्यतिरिक्त (ARDM1, HSPA8, PSMD14, आणि PSMC3) दोन पद्धतींनी ओळखल्या जातात (Fig. 5c)43.एलसी-एमएस/एमएसचे परिणाम अधिक प्रमाणित करण्यासाठी, पीडीपीएल उपचार आणि त्यानंतरच्या वेस्टर्न ब्लॉटिंगचा वापर HEK293T पॅरेंट सेल परख आणि स्थिर एन-टर्मिनल पार्किन लाइनच्या परिणामांची तुलना करण्यासाठी केला गेला.पूर्वी अज्ञात लक्ष्य CDK2, DUT, CTBP1, आणि PSMC4 ची चाचणी ज्ञात बाईंडर, DNAJB1 (Fig. 5d) सह केली गेली होती.
पार्किनच्या N- किंवा C-टर्मिनस (n = 3 स्वतंत्र जैविक प्रयोग) मध्ये स्थिरपणे व्यक्त केलेल्या miniSOG सह HEK293T पेशींमध्ये पार्किन-इंटरॅक्टिंग प्रोटीनचा ज्वालामुखी प्लॉट.ज्वालामुखीच्या भूखंडांवर दोन-पुच्छ विद्यार्थ्यांची टी-चाचणी वापरली गेली.HEK293T नकारात्मक नियंत्रण म्हणून वापरले गेले. लक्षणीय बदललेली प्रथिने लाल रंगात हायलाइट केली जातात (p <0.05 आणि > 2-पट आयन तीव्रता फरक). लक्षणीय बदललेली प्रथिने लाल रंगात हायलाइट केली जातात (p <0.05 आणि > 2-पट आयन तीव्रता फरक). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). लक्षणीय बदललेली प्रथिने लाल रंगात ठळक केली जातात (p <0.05 आणि आयन तीव्रतेमध्ये >2-पट फरक).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05和>2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). लक्षणीय बदललेली प्रथिने लाल रंगात ठळक केली जातात (p <0.05 आणि > आयनिक सामर्थ्यात 2-पट फरक).संबंधित प्रथिने HEK293T-miniSOG साठी महत्वाचे आहेत परंतु HEK293T साठी महत्वाचे नाहीत हिरव्या रंगात दर्शविले आहेत.b वेन आकृती एन-टर्मिनल आणि सी-टर्मिनल रचनांमध्ये आच्छादित प्रथिने दर्शवित आहे.एन-टर्मिनल टॅग्स पार्किनला अनियंत्रितपणे सक्रिय करू शकतात आणि परिणामी अधिक ओळखण्यायोग्य प्रथिने बनतात.c वेन आकृती PDPL आणि AP-MS मधील आच्छादित प्रथिने दर्शवित आहे.ज्ञात परस्परसंवादी सूचीबद्ध आहेत, ज्यामध्ये 18 पैकी 4 आच्छादित प्रथिने आणि PDPL मध्ये विशेषतः ओळखल्या गेलेल्या 159 पैकी 11 प्रथिने समाविष्ट आहेत.d LC-MS/MS द्वारे ओळखले जाणारे प्रतिनिधी लक्ष्य वेस्टर्न ब्लॉटिंगद्वारे सत्यापित केले गेले.e Ssu72 आणि SNW1 ची नोंदणी नसलेली पार्कीन सब्सट्रेट्स म्हणून ओळख झाली.हे FLAG-टॅग केलेले प्रोटीन प्लाझमिड्स HEK293T आणि HEK293T-पार्किन-मिनीएसओजी मध्ये बदलले गेले आणि त्यानंतर विविध टाइम पॉइंट्सवर CCCP उपचार केले गेले.पार्किन ओव्हरएक्सप्रेशन लाइनमध्ये ऱ्हास अधिक स्पष्ट होता.f प्रोटीसोम इनहिबिटर MG132 वापरून, Ssu72 आणि SNW1 ची अधोगती प्रक्रिया प्रोटीसोम-सर्वव्यापकीकरणाद्वारे मध्यस्थी होते याची पुष्टी झाली.समान परिणामांसह हे प्रयोग स्वतंत्रपणे किमान दोनदा पुनरावृत्ती झाले.कच्चा डेटा रॉ डेटा फाइल्सच्या स्वरूपात प्रदान केला जातो.
विशेष म्हणजे, PDPL द्वारे ओळखल्या जाणार्‍या प्रथिनांमध्ये पार्किन-बाइंडिंग प्रथिने आणि त्यांचे थर समाविष्ट असणे आवश्यक आहे.अनोंदणीकृत पार्किन सब्सट्रेट्स शोधण्यासाठी, आम्ही सात ओळखले प्रथिने (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 आणि SNW1) आणि ट्रान्सफेक्टेड प्लाझमिड्स निवडले ज्यामुळे ही जीन्स सामान्य HEK293T मध्ये उघडकीस येतील आणि मिनीएसओजी-पार्किन्स 2CCTCPHE2 सीसीपीएचई उपचारांद्वारे स्थिरपणे व्यक्त केले जातील.Ssu72 आणि SNW1 प्रथिनांचे स्तर स्थिर मिनीएसओजी-पार्किन लाइन (चित्र 5e) मध्ये लक्षणीयरीत्या कमी झाले.CCCP सह 12 तास उपचार केल्याने दोन्ही सब्सट्रेट्सचे सर्वात लक्षणीय ऱ्हास झाला.Ssu72 आणि SNW1 चे ऱ्हास हे प्रोटीसोम-सर्वव्यापकीकरणाद्वारे नियंत्रित केले जाते की नाही हे तपासण्यासाठी, प्रोटीसोम क्रियाकलाप रोखण्यासाठी प्रोटीझोम इनहिबिटर MG132 जोडले गेले होते, आणि प्रत्यक्षात आम्हाला आढळले की त्यांची ऱ्हास प्रक्रिया प्रतिबंधित केली गेली होती (चित्र 5f).वेस्टर्न ब्लॉटिंग (पूरक अंजीर 10) वापरून पार्किन इंटरॅक्टर्स म्हणून अतिरिक्त नॉन-सबस्ट्रेट लक्ष्यांची पुष्टी केली गेली, ज्याने LC-MS/MS सह सुसंगत परिणाम दाखवले.शेवटी, PDPL वर्कफ्लोचे लक्ष्य प्रोटीन ट्रान्सफेक्शन पडताळणीसह एकीकरण केल्याने नोंदणी न केलेल्या E3 ligase सब्सट्रेट्सची ओळख पटवता येते.
आम्ही एक सामायिक प्रॉक्सिमिटी मार्किंग प्लॅटफॉर्म विकसित केला आहे जो तुम्हाला स्पेस आणि टाइम इंटरअॅक्शन POI ओळखण्याची परवानगी देतो.प्लॅटफॉर्म मिनीएसओजी फोटोसेन्सिटायझर प्रोटीनवर आधारित आहे, जे फक्त 12 kDa आहे, प्रौढ APEX2 एन्झाइम (27 kDa) च्या अर्ध्यापेक्षा कमी आणि TurboID (35 kDa) च्या एक तृतीयांश आकाराचे आहे.लहान आकाराने लहान प्रथिने इंटरेक्टॉम्सचा अभ्यास करण्यासाठी अनुप्रयोगांची श्रेणी मोठ्या प्रमाणात विस्तृत केली पाहिजे.एकल ऑक्सिजनचे क्वांटम उत्पन्न वाढवण्यासाठी आणि या दृष्टिकोनाची संवेदनशीलता वाढवण्यासाठी, अनुवांशिकरित्या एन्कोड केलेले प्रथिने किंवा लहान रेणू असोत, अतिरिक्त फोटोसेन्सिटायझर्सचा पुढील शोध आवश्यक आहे.miniSOG च्या वर्तमान आवृत्तीसाठी, प्रॉक्सिमिटी मार्कर सक्रिय करण्यासाठी निळ्या प्रदीपन वापरून उच्च टेम्पोरल रिझोल्यूशन प्राप्त केले जाऊ शकते.याव्यतिरिक्त, जास्त काळ एक्सपोजर वेळेमुळे सिंगलट ऑक्सिजनचा एक मोठा "क्लाउड" सोडला, ज्यामुळे अधिक डिस्टल हिस्टिडाइन अवशेषांमध्ये बदल, लेबलिंग त्रिज्या वाढली आणि PDPL अवकाशीय रिझोल्यूशन फाइन-ट्यून करण्याची क्षमता.आम्ही सिग्नल-टू-पार्श्वभूमी गुणोत्तर वाढवण्यासाठी सात रासायनिक प्रोबची चाचणी देखील केली आणि या दृष्टिकोनामागील आण्विक यंत्रणा शोधली.TOP-ABPP वर्कफ्लो निःपक्षपाती खुल्या शोधासह एकत्रितपणे पुष्टी केली की बदल केवळ हिस्टिडाइनमध्येच झाले आहेत आणि हिस्टिडाइनच्या वाढीव बदलांसाठी कोणतेही सुसंगत सूक्ष्म वातावरण दिसले नाही, लूप प्रदेशातील हिस्टिडाइनसाठी मध्यम प्राधान्य वगळता.
पीडीपीएलचा वापर प्रोटीओम विशिष्टतेसह सबसेल्युलर प्रोटीओम्सचे वैशिष्ट्य आणि इतर समीपतेच्या लेबलिंग आणि ऑर्गेनेल-विशिष्ट रासायनिक तपासणी पद्धतींशी किमान तुलनात्मक कव्हरेज करण्यासाठी देखील केला गेला आहे.प्रॉक्सिमिटी मार्करचा वापर पृष्ठभाग, लाइसोसोमल आणि सेक्रेटॉम-संबंधित प्रोटीओम्स 46,47 चे वैशिष्ट्य दर्शवण्यासाठी देखील केला गेला आहे.आमचा विश्वास आहे की PDPL या सबसेल्युलर ऑर्गेनेल्सशी सुसंगत असेल.याव्यतिरिक्त, आम्ही PDPL ला आव्हान दिले की सायटोसोलिक प्रथिन बंधनासाठी लक्ष्य ओळखले जाते जे त्यांच्या गतिशील गुणधर्मांमुळे आणि अधिक तात्पुरत्या परस्परसंवादांमध्ये सहभागामुळे झिल्ली बद्ध प्रोटीनपेक्षा अधिक जटिल आहेत.PDPL दोन प्रथिने, ट्रान्सक्रिप्शनल कोएक्टिवेटर BRD4 आणि रोग-संबंधित ligase E3 Parkin वर लागू केले गेले.ही दोन प्रथिने केवळ त्यांच्या मूलभूत जैविक कार्यांसाठीच नव्हे, तर त्यांच्या वैद्यकीय प्रासंगिकतेसाठी आणि उपचारात्मक क्षमतेसाठी देखील निवडली गेली.या दोन POI साठी, सुप्रसिद्ध बंधनकारक भागीदार तसेच नोंदणी नसलेले लक्ष्य ओळखले गेले.विशेष म्हणजे, फेज सेपरेशन-संबंधित प्रोटीन SFPQ सह-IP द्वारे पुष्टी केली गेली, जी एक नवीन यंत्रणा दर्शवू शकते ज्याद्वारे BRD4 (शॉर्ट आयसोफॉर्म) LLPS चे नियमन करते.त्याच वेळी, आमचा विश्वास आहे की पार्किन सब्सट्रेट्सची ओळख ही एक परिस्थिती आहे ज्यामध्ये अप्रत्यक्ष चिकटपणाची ओळख आवश्यक आहे.आम्ही दोन अनोळखी पार्किन सब्सट्रेट्स ओळखले आणि सर्वव्यापी-प्रोटीसोम मार्गासह त्यांच्या ऱ्हासाची पुष्टी केली.अलीकडे, हायड्रोलेज सब्सट्रेट्सला एन्झाईम्सच्या सापळ्यात अडकवून शोधण्यासाठी यंत्रणा-आधारित ट्रॅपिंग धोरण विकसित केले गेले आहे.ही एक अतिशय शक्तिशाली पद्धत असली तरी, मोठ्या कॉम्प्लेक्सच्या निर्मितीमध्ये सामील असलेल्या सब्सट्रेट्सच्या विश्लेषणासाठी ती योग्य नाही आणि एंझाइम आणि सब्सट्रेट दरम्यान सहसंयोजक बंध तयार करणे आवश्यक आहे.आम्ही अपेक्षा करतो की पीडीपीएल इतर प्रथिने कॉम्प्लेक्स आणि एन्झाइम कुटुंबांचा अभ्यास करण्यासाठी विस्तारित केले जाऊ शकते, जसे की डेबिक्विटिनेज आणि मेटालोप्रोटीज कुटुंबे.
SOPP3 नावाचा miniSOG चा एक नवीन प्रकार, सुधारित सिंगल ऑक्सिजन उत्पादनासह विकसित केला गेला आहे.आम्ही miniSOG ची SOPP3 शी तुलना केली आणि सुधारित चिन्हांकन कार्यप्रदर्शन आढळले, जरी सिग्नल-टू-आवाज गुणोत्तर अपरिवर्तित राहिले (पूरक चित्र 11).आम्ही असे गृहित धरले की SOPP3 चे ऑप्टिमायझेशन (उदा. निर्देशित उत्क्रांतीद्वारे) अधिक कार्यक्षम फोटोसेन्सिटायझर प्रथिने निर्माण करेल ज्यांना कमी प्रकाश वेळ आवश्यक आहे आणि त्यामुळे अधिक गतिशील सेल्युलर प्रक्रिया कॅप्चर करणे शक्य होईल.विशेष म्हणजे, PDPL ची वर्तमान आवृत्ती सेल्युलर वातावरणापुरती मर्यादित आहे कारण त्याला निळा प्रकाश आवश्यक आहे आणि खोल ऊतींमध्ये प्रवेश करू शकत नाही.हे वैशिष्ट्य प्राणी मॉडेल अभ्यासामध्ये त्याचा वापर प्रतिबंधित करते.तथापि, PDPL सह ऑप्टोजेनेटिक्सचे संयोजन प्राण्यांच्या संशोधनासाठी, विशेषत: मेंदूमध्ये संधी प्रदान करू शकते.याशिवाय, इतर इंजिनीयर्ड इन्फ्रारेड फोटोसेन्सिटायझर्स देखील ही मर्यादा काढून टाकतात.सध्या या क्षेत्रात संशोधन सुरू आहे.
HEK293T सेल लाइन ATCC (CRL-3216) कडून प्राप्त झाली.सेल लाइनची मायकोप्लाझ्मा संसर्गासाठी नकारात्मक चाचणी केली गेली आणि DMEM (थर्मो, #C11995500BT) मध्ये 10% भ्रूण बोवाइन सीरम (FBS, Vistech, #SE100-B) आणि 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमायसिन (हायक्लोन, #SV3) सह संवर्धन केले गेले.मध्ये वाढले.
3-अमीनोफेनिलिन (नमुना 3) आणि (4-एथिनिलफेनिल) मिथेनामाइन (नमुना 4) बिडेफार्मकडून खरेदी केले गेले.प्रोपाइलमाइन (प्रोब 2) एनर्जी-केमिकल्समधून खरेदी केले गेले.एन-(2-अमीनोफेनिल) पेंट-4-यानामाइड (प्रोब 1) प्रकाशित पद्धतींनुसार संश्लेषित केले गेले.
पूरक तक्ता 1 या अभ्यासात वापरलेल्या अनुवांशिक रचनांची सूची देते.miniSOG आणि KillerRed अनुक्रमे P. Zou (Peking University) कडील गिफ्ट प्लाझमिडमधून क्लोन केले गेले.माइटोकॉन्ड्रियल मॅट्रिक्स लक्ष्यीकरण अनुक्रम COX4 च्या 23 N-टर्मिनल अमीनो ऍसिडमधून प्राप्त केले गेले आणि गिब्सन असेंब्ली (Beyotime, #D7010S) वापरून सूचित वेक्टरमध्ये क्लोन केले गेले.एंडोप्लाज्मिक रेटिक्युलमच्या झिल्ली आणि केंद्रकांना लक्ष्य करण्यासाठी, SEC61B मानवी DNA (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) HEK293T पेशींच्या cDNA लायब्ररीतून PCR द्वारे प्रवर्धित केले गेले आणि H2B DNA (डी. लिन, बा शेनझेन यांनी दान केलेले) आणि क्लोन केलेले, वर नमूद केल्याप्रमाणे.अन्यथा सूचित केल्याशिवाय, HEK293T सेल cDNA लायब्ररीमधून रक्तसंक्रमण आणि स्थिर सेल लाईन्सच्या बांधकामासाठी वापरल्या जाणार्‍या इतर प्रथिने जनुकांचे PCR वाढवण्यात आले.G3S (GGGS) आणि G4S (GGGGS) चा प्रलोभन प्रथिने आणि miniSOG मधील लिंकर म्हणून वापर केला गेला.एक V5 एपिटोप टॅग (GKPIPNPLLGLDST) या फ्यूजन रचनांमध्ये जोडला गेला.सस्तन प्राण्यांमध्ये अभिव्यक्तीसाठी आणि स्थिर सेल लाइन स्थापित करण्यासाठी, miniSOG फ्यूजन कंस्ट्रक्ट pLX304 लेन्टीव्हायरल वेक्टरमध्ये सबक्लोन केले गेले.जिवाणू अभिव्यक्तीसाठी, miniSOG सी-टर्मिनस येथे 6xHis लेबल केलेल्या pET21a वेक्टरमध्ये क्लोन केले गेले.
HEK293T पेशी 2.0 x 105 पेशी प्रति विहिरीमध्ये सहा-वेल प्लेट्समध्ये सीड केल्या गेल्या आणि 24 तासांनंतर रीकॉम्बीनंट लेन्टीव्हायरल प्लाझमिड्स (2.4 μg pLX304) आणि व्हायरल पॅकेजिंग प्लाझमिड्स (1.5 μg psPAX2 आणि 1.2 μg psPAX2 आणि 1.2 μg0000 टाइम्स LiBpog08 वापरून) सह संक्रमित केले. , #C0533), सुमारे 80% फ्यूजन.रात्रभर संक्रमणानंतर, माध्यम बदलले आणि आणखी 24 तास उष्मायन केले.24, 48 आणि 72 तासांनंतर व्हायरसचे संकलन करण्यात आले.लक्ष्य सेल लाइन्सच्या संसर्गापूर्वी, विषाणू माध्यम 0.8 μm फिल्टरद्वारे फिल्टर केले गेले होते (मर्क, #मिलेक्स-जीपी) आणि पॉलीब्रेन (सोलर्बियो, #H8761) 8 μg/ml च्या एकाग्रतेमध्ये जोडले गेले होते.24 तासांनंतर, पेशींना माध्यम बदलून पुनर्प्राप्त करण्याची परवानगी दिली गेली.कमी कडक निवड म्हणून पहिल्या तीन परिच्छेदांसाठी 5 μg/ml blasticidin (Solarbio, #3513-03-9) वापरून पेशी निवडल्या गेल्या.नंतर पुढील तीन परिच्छेदांसाठी 20 μg/ml अधिक कडक पथ्ये म्हणून वापरले.
पेशी 12-विहिरी कक्षांमध्ये (Ibidi, #81201) प्रति विहिरी अंदाजे 20,000 पेशींच्या घनतेमध्ये तयार केल्या गेल्या.HEK293T पेशींचे आसंजन सुधारण्यासाठी, फॉस्फेट बफर सलाईन (PBS, सांगोन, #B640435) मध्ये 37°C तापमानात 50 µg/ml फायब्रोनेक्टिन (कॉर्निंग, #356008) मिसळा.चेंबर्स 1 तासासाठी प्रीट्रीट केले गेले आणि नंतर पीबीएसने काढले गेले.२४ तासांनंतर, पेशी एकदा पीबीएसने धुतल्या जातात, ताज्या हॅन्क्सच्या संतुलित मीठ द्रावणात (HBSS, Gibco, #14025092) 1 mM प्रोब 3 सह 37°C तापमानावर 1 तास उष्मायन केले जातात, आणि नंतर निळ्या एलईडी (460 nm) ने उष्मायन केले जाते. ).) खोलीच्या तपमानावर 10 मिनिटांसाठी विकिरणित केले गेले.त्यानंतर, पेशी PBS सह दोनदा धुतल्या गेल्या आणि PBS (Sangon, #E672002) मध्ये 4% फॉर्मल्डिहाइडसह खोलीच्या तापमानावर 15 मिनिटांसाठी निश्चित केले गेले.PBS सह तीन वेळा धुऊन स्थिर पेशींमधून अतिरिक्त फॉर्मल्डिहाइड काढून टाकण्यात आले.त्यानंतर पेशींना PBS मध्ये 0.5% ट्रायटन X-100 (सांगॉन, #A600198) सह पारगम्य केले गेले आणि PBS सह 3 वेळा धुतले गेले.नंतर चेंबर काढा आणि प्रत्येक नमुन्यात 50 µM Cy3-azide (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) असलेल्या क्लिक प्रतिक्रिया मिश्रणाच्या 25 μl जोडा. आणि 0.5 mg/ml सोडियम एस्कॉर्बेट (अलादीन, क्र. S105024) आणि खोलीच्या तपमानावर 30 मिनिटे उष्मायन केले जाते.स्नॅप रिअॅक्शननंतर, 0.05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) असलेल्या PBS सह पेशी सहा वेळा धुतल्या गेल्या आणि नंतर खोलीच्या तापमानावर 30 मिनिटांसाठी PBST मध्ये 5% BSA (Abcone, #B24726) सह ब्लॉक केले गेले.
कोलोकलायझेशन इम्युनोस्टेनिंगसाठी, सूचित परिस्थितींनुसार पेशींना प्राथमिक प्रतिपिंडांसह उष्मायन केले गेले: माउस अँटी-व्ही5 टॅग mAb (1:500, CST, #80076), ससा अँटी-Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), ससा पॉलीक्लोनल अँटी-कॅल्नेक्सिन अँटीबॉडी (1:500, Abcam, #ab22595) किंवा ससा अँटी-लॅमिन A/C मोनोक्लोनल अँटीबॉडी (1:500; CST, #2032) रात्रभर 4 °C वर.PBST सह 3 वेळा धुतल्यानंतर, पेशी दुय्यम प्रतिपिंडांसह उबवल्या गेल्या: शेळी-अँटी-रॅबिट अलेक्सा फ्लोर 488 (थर्मो, #A11034) 1:1000 पातळ केले, शेळी-विरोधी अलेक्सा फ्लोर 594 (CST, #8889) 1:100 पातळ केले.dilution खोलीच्या तपमानावर 30 मिनिटे पातळ करा.त्यानंतर पेशी 3 वेळा PBST ने धुतल्या गेल्या आणि DAPI (थर्मो, #D1306) ने PBS मध्ये खोलीच्या तापमानावर 10 मिनिटांसाठी काउंटरस्टेन केले.PBS सह 3 वॉश केल्यानंतर, इमेजिंगसाठी PBS मध्ये 50% ग्लिसरॉल (Sangon, #A600232) मध्ये पेशी सील केल्या गेल्या.ZEISS LSM 900 Airyscan2 कॉन्फोकल मायक्रोस्कोप आणि ZNE 3.5 सॉफ्टवेअर वापरून इम्युनोफ्लोरोसंट प्रतिमा प्राप्त केल्या गेल्या.
सिंगल ऑक्सिजन फ्लोरोसेंट इमेजिंगसाठी, हँक्स एचईपीईएस बफर (डोजिंदो, #MT05) मध्ये 100 nM Si-DMA जोडण्यापूर्वी हँक्स HEPES बफरसह पेशी दोनदा धुतल्या गेल्या.प्रकाशाच्या संपर्कात आल्यानंतर, पेशी CO2 इनक्यूबेटरमध्ये 37°C तापमानात 45 मिनिटे उबवल्या गेल्या.त्यानंतर हँक्सच्या HEPES बफरने पेशी दोनदा धुतल्या गेल्या आणि खोलीच्या तपमानावर 10 मिनिटांसाठी हँक्सच्या HEPES बफरमध्ये Hoechst ने काउंटरस्टेन केले आणि ZEISS LSM 900 कॉन्फोकल मायक्रोस्कोप वापरून दृश्यमान केले., #M36008) कॅल्शियम आणि मॅग्नेशियम असलेल्या HBSS बफरमध्ये.प्रकाश किंवा डॉक्सोरुबिसिन (MCE, #HY-15142A) च्या संपर्कात आल्यानंतर, पेशी CO2 इनक्यूबेटरमध्ये 37° से. तापमानात 10 मिनिटांसाठी उष्मायनात ठेवल्या गेल्या, HBSS बफरने दोनदा धुतल्या आणि HBSS बफरमध्ये Hoechst ने खोलीच्या तपमानावर उष्मायन केले.मिनिटेडॉक्सोरुबिसिनचा उपयोग सकारात्मक तपासणी नियंत्रण म्हणून केला गेला जिथे पेशींवर 30 मिनिटांसाठी 1% BSA असलेल्या HBSS मध्ये 20 μM डॉक्सोरुबिसिनने उपचार केले गेले.Zeiss LSM 900 कॉन्फोकल मायक्रोस्कोप वापरून इम्युनोफ्लोरोसंट प्रतिमा प्राप्त केल्या गेल्या.
HEK293T पेशी स्थिरपणे mito-miniSOG व्यक्त करणार्‍या 15 सेमी डिशेसमध्ये अंदाजे 30% घनतेवर सीड केल्या गेल्या.48 तासांनंतर, जेव्हा ~80% संगम झाला तेव्हा, पेशी एकदा PBS सह धुतल्या गेल्या, ताज्या HBSS बफरमध्ये 1 मिमी प्रोब 3 सह 37 डिग्री सेल्सिअस तापमानात 1 तास उष्मायन केले गेले आणि नंतर खोलीत 10 मिनिटे निळ्या एलईडीने प्रकाशित केले. तापमान.त्यानंतर, पेशी दोनदा पीबीएसने धुतल्या गेल्या, स्क्रॅप केल्या गेल्या आणि EDTA-मुक्त प्रोटीज इनहिबिटर (MCE, #HY-K0011) असलेल्या बर्फ-थंड PBS बफरमध्ये पुन्हा निलंबित केल्या गेल्या.1 मिनिट (35% मोठेपणावर 1 सेकंद चालू आणि 1 सेकंद बंद) टीप sonicating करून पेशी lysed होते.परिणामी मिश्रण 15,871 xg वर 10 मिनिटांसाठी 4°C वर भंगार काढून टाकण्यासाठी केंद्रीत केले गेले आणि BCA प्रोटीन परख किट (Beyotime, #P0009) वापरून सुपरनॅटंट एकाग्रता 4 mg/mL वर समायोजित केली गेली.वरील लाइसेटचे 1 मिली 0.1 मिमी फोटोडिग्रेडेबल बायोटिन अॅझाइड (कन्फ्लोर, #BBBD-14), 1 मिमी टीसीईपी (सांगॉन, #A600974), 0.1 मिमी टीबीटीए लिगँड (अलादीन, #T162437), आणि 1 एमएम क्यूबएटर तळाशी एकत्र करा. खोलीच्या तपमानावर 1 तासासाठी फिरवा.स्नॅप रिअॅक्शननंतर, 10 मिली काचेच्या कुपीमध्ये मिश्रण पूर्व-मिश्रित द्रावणात (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) घाला.खोलीच्या तपमानावर 10 मिनिटांसाठी नमुने मिसळून 4500 ग्रॅमवर ​​सेंट्रीफ्यूज केले गेले.खालचे आणि वरचे द्रावण टाकून दिले गेले, 1 मिली मिथेनॉलने अवक्षेपण दोनदा धुतले गेले आणि 15871×g वर 4°C वर 5 मिनिटांसाठी सेंट्रीफ्यूज केले गेले.अवक्षेपण विरघळण्यासाठी 25 मिमी अमोनियम बायकार्बोनेट (ABC, Aladdin, no. A110539) मध्ये 1 मिली 8 एम युरिया (अलादीन, क्र. U111902) घाला.नमुने 10 mM dithiothreitol (Sangon, #A100281 in 25 mM ABC) 55°C तापमानावर 40 मिनिटांसाठी पुनर्रचना करण्यात आले आणि त्यानंतर अंधारात खोलीच्या तपमानावर 15 mM ताजे आयोडोएसीटामाइड (सांगॉन, #A600539) जोडले गेले.30 मिनिटांच्या आत अल्किलेशन..प्रतिक्रिया थांबवण्यासाठी अतिरिक्त 5 एमएम डिथिओथ्रेटॉल जोडले गेले.प्रत्येक नमुन्यासाठी अंदाजे 100 μl NeutrAvidin agarose beds (Thermo, #29202) 1 ml PBS ने 3 वेळा धुवून तयार करा.वरील प्रोटीओम द्रावण 5 मिली पीबीएसने पातळ केले गेले आणि खोलीच्या तापमानात 4 तासांसाठी पूर्व धुतलेल्या न्यूट्रॅव्हिडिन अॅग्रोज मणीसह उबवले गेले.नंतर मणी 0.2% SDS (Sangon, #A600485) असलेल्या 5 ml PBS ने 3 वेळा, 1M युरिया असलेल्या 5 ml PBS ने 3 वेळा आणि 5 ml ddH2O ने 3 वेळा धुतले.त्यानंतर सेंट्रीफ्यूगेशनद्वारे मणी कापणी केली गेली आणि 200 μl 25 mM ABC मध्ये 1 M युरिया, 1 mM CaCl 2 (मॅकलिन, #C805228) आणि 20 ng/μl ट्रिप्सिन (प्रोमेगा, #V5280) समाविष्टीत पुनर्संचयित केले गेले.रोटेशनसह 37°C वर रात्रभर ट्रिप्सिनाइज करा.pH 2-3 पर्यंत पोहोचेपर्यंत फॉर्मिक ऍसिड (थर्मो, # A117-50) जोडून प्रतिक्रिया थांबविली गेली.मणी 0.2% एसडीएस असलेल्या 1 मिली पीबीएसने 3 वेळा, 1 एम यूरिया असलेल्या 1 मिली पीबीएसने 3 वेळा आणि नंतर 1 मिली डिस्टिल्ड वॉटरने 3 वेळा धुतले गेले.70% MeOH च्या 200 μl वापरून 90 मिनिटांसाठी सुधारित पेप्टाइड्स लाईट लिसिस (365 nm) द्वारे सोडण्यात आले.सेंट्रीफ्यूगेशननंतर, सुपरनेटंट गोळा केले गेले.नंतर मणी 70% MeOH च्या 100 μl सह एकदा धुतले गेले आणि सुपरनेटंट्स एकत्र केले गेले.स्पीडव्हॅक व्हॅक्यूम कॉन्सन्ट्रेटरमध्ये नमुने वाळवले गेले आणि विश्लेषण होईपर्यंत -20 डिग्री सेल्सिअस तापमानात साठवले गेले.
सिंगलट ऑक्सिजन सुधारित पेप्टाइड्स ओळखण्यासाठी आणि त्याचे प्रमाण निश्चित करण्यासाठी, नमुने 0.1% फॉर्मिक ऍसिडमध्ये पुन्हा विरघळले गेले आणि 1 μg पेप्टाइड्सचे विश्लेषण ऑर्बिट्रॅप फ्यूजन ल्युमोस ट्रायब्रिड मास स्पेक्ट्रोमीटरने ट्यून आणि एक्सकॅलिबर विक्रेत्याच्या सॉफ्टवेअर 4 कडून नॅनो ईएसआय स्त्रोतासह सुसज्ज केले गेले.नमुने 75 µm × 15 सेमी अंतर्गत पॅक केलेल्या केशिका स्तंभावर 3 µm C18 सामग्रीसह वेगळे केले गेले (ReproSil-pur, #r13.b9.) आणि EASY-nLC 1200 UHPLC प्रणाली (थर्मो) शी जोडले गेले.पेप्टाइड्स रेखीय 95 मिनिटांच्या ग्रेडियंट क्रोमॅटोग्राफीद्वारे 8% सॉल्व्हेंट बी पासून 50% सॉल्व्हेंट बी (पाण्यात A = 0.1% फॉर्मिक ऍसिड, 80% एसीटोनिट्रिलमध्ये B = 0.1% फॉर्मिक ऍसिड), नंतर रेखीयपणे 98% B मिनिटापर्यंत विभक्त केले गेले. 300 nl/min च्या प्रवाह दराने 6 मिनिटांत.ऑर्बिट्रॅप फ्यूजन लुमोस डेटाच्या आधारावर संपूर्ण MS स्कॅन आणि MS2 स्कॅन दरम्यान डेटा एकत्रित करते.स्पटरिंग व्होल्टेज 2.1 kV वर सेट केले होते आणि आयन ट्रान्सपोर्ट केशिकाचे तापमान 320°C होते.एमएस स्पेक्ट्रा (350-2000 m/z) 120,000, AGC 4 × 105, आणि 150 ms च्या कमाल इनपुट वेळेसह गोळा केले गेले.प्रत्येक पूर्ण स्कॅनमध्ये 10 सर्वात सामान्य गुणाकार चार्ज केलेले पूर्ववर्ती HCD वापरून 30% च्या सामान्यीकृत टक्कर उर्जेसह, 1.6 m/z च्या क्वाड्रपोल आयसोलेशन विंडो आणि 30,000 च्या रिझोल्यूशन सेटिंगसह खंडित केले गेले.5×104 आणि कमाल इनपुट वेळ 150 ms वापरून टेंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्रीसाठी AGC लक्ष्य.डायनॅमिक अपवाद 30 सेकंदांवर सेट केला आहे. MS/MS साठी नियुक्त न केलेले आयन किंवा 1+ आणि >7+ शुल्क असलेले आयन नाकारले गेले. MS/MS साठी नियुक्त न केलेले आयन किंवा 1+ आणि >7+ शुल्क असलेले आयन नाकारले गेले. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ आणि >7+ были отклонены для МС/МС. MS/MS साठी 1+ आणि >7+ च्या शुल्कासह असाइन न केलेले आयन किंवा आयन नाकारले गेले.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ आणि >7+ были отклонены для МС/МС. MS/MS साठी 1+ आणि >7+ चे शुल्क असलेले अनिर्दिष्ट आयन किंवा आयन नाकारले गेले.
MSFragger वर आधारित FragPipe संगणकीय प्लॅटफॉर्म वापरून कच्च्या डेटावर प्रक्रिया केली जाते.वस्तुमान पूर्वाग्रह आणि संबंधित अमीनो ऍसिड -150 ते 500 Da च्या पूर्ववर्ती वस्तुमान सहिष्णुतेसह ओपन सर्च अल्गोरिदम वापरून निर्धारित केले गेले.सुधारित पेप्टाइड्स नंतर पीडी (प्रोटीओम डिस्कवरर 2.5, थर्मो) मध्ये +229.0964 आणि +247.1069 Da च्या मोठ्या प्रमाणात वाढीसह हिस्टिडाइन बदल वापरून ओळखले गेले.
6 सेंटीमीटरच्या डिशेसमध्ये फ्यूज केलेले मिनीएसओजी जनुक स्थिरपणे व्यक्त करणार्‍या पेशी.~80% संगमावर पोहोचल्यावर, पेशी HBSS (Gibco, #14025092) सह एकदा धुतल्या गेल्या, नंतर HBSS मध्ये रासायनिक प्रोबने 37°C तापमानावर 1 तास उष्मायन केले आणि निळ्या प्रकाशाने प्रकाशित केले.खोलीच्या तपमानावर 20 मिनिटांसाठी 10W LED.PDPL मध्ये कोणत्या प्रकारच्या प्रतिक्रियाशील ऑक्सिजन प्रजातींचा समावेश आहे हे निर्धारित करण्यासाठी, 0.5 mM व्हिटॅमिन C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (सिग्मा, #7789-20-0) , 100 mM मॅनिटोल (एनर्जी केमिकल, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 पेशींना पूरक म्हणून जोडले गेले.कोल्ड पीबीएसने धुतल्यानंतर, पेशी स्क्रॅप केल्या गेल्या, 1.5 मिली सेंट्रीफ्यूज ट्यूबमध्ये गोळा केल्या गेल्या आणि EDTA शिवाय 1x प्रोटीज इनहिबिटरसह PBS च्या 200 μl मध्ये 1 मिनिट टीपसह सोनिकेटेड (1 s आणि 1 s शिवाय, मोठेपणा 35%).परिणामी मिश्रण 15,871 × g वर 10 मिनिटांसाठी 4 °C तापमानावर सेंट्रीफ्यूज केले गेले आणि BCA प्रोटीन परख किट वापरून सुपरनॅटंट एकाग्रता 1 mg/mL वर समायोजित केली गेली.वरील लायसेटपैकी अंदाजे 50 μl 0.1 मिमी रोडामाइन अझाइड (अलादीन, क्रमांक T131368), 1 मिमी टीसीईपी, 0.1 मिमी टीबीटीए लिगँड आणि 1 मिमी क्यूएसओ 4 खोलीच्या तापमानावर 1 तासासाठी तळापासून वरच्या दिशेने फिरवून उष्मायन करण्यात आले.क्लिक रिअॅक्शननंतर, नमुन्यांमध्ये 250 μl प्री-चिल्ड एसीटोन जोडून, ​​-20°C वर 20 मिनिटांसाठी उष्मायन करून आणि 4°C तापमानावर 10 मिनिटांसाठी 6010×g वर सेंट्रीफ्यूग करून एसीटोनसह पर्जन्यवृष्टी केली गेली.गोळी गोळा करा आणि 50 µl 1x Laemmli च्या बफरमध्ये 95 °C तापमानावर 10 मिनिटे उकळा.नंतर SDS-PAGE लाँग जेलवर नमुने विश्लेषित केले गेले आणि इमेज लॅब टच सॉफ्टवेअरसह बायो-रॅड केमीडॉक एमपी टच इमेजिंग सिस्टम वापरून दृश्यमान केले गेले.
पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे रीकॉम्बीनंट miniSOG-6xHis प्रोटीनची अभिव्यक्ती आणि शुद्धीकरण केले गेले.थोडक्यात, E. coli BL21(DE3) पेशी (TransGen, #CD701-02) चे रूपांतर pET21a-miniSOG-6xHis सह झाले आणि प्रथिने अभिव्यक्ती 0.5 mM IPTG (Sangon, #A600168) सह प्रेरित झाली.सेल लिसिसनंतर, प्रथिने नि-एनटीए ऍग्रोज मणी (MCE, क्रमांक 70666) वापरून शुद्ध केली गेली, PBS विरुद्ध डायलायझ केली गेली आणि -80°C वर साठवली गेली.
अँटीबॉडी-आधारित इन विट्रो लेबल प्रॉक्सिमिटी परखसाठी, PBS मध्ये 100 μM शुद्ध केलेले miniSOG, 1 mM प्रोब 3, आणि 1 μg अँटी-लेबल माउस मोनोक्लोनल अँटीबॉडी (TransGen, #HT501-01) एकूण 50 μl प्रतिक्रिया व्हॉल्यूममध्ये मिसळा..प्रतिक्रियेचे मिश्रण खोलीच्या तपमानावर 0, 2, 5, 10 आणि 20 मिनिटांसाठी निळ्या एलईडी लाइटने विकिरणित होते.हे मिश्रण 0.1 mM बायोटिन-PEG3-azide (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligand, आणि 1 mM CuSO4 खोलीच्या तपमानावर 1 तासासाठी ऊर्ध्वगामी मोशन शेकरवर उबवलेले होते.स्नॅप रिअ‍ॅक्शननंतर, मिश्रणात थेट 4x Laemmli चा बफर घाला आणि 95°C वर 10 मिनिटे उकळा.SDS-PAGE gels वर नमुन्यांचे विश्लेषण केले गेले आणि स्ट्रेप्टाव्हिडिन-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068) सह वेस्टर्न ब्लॉटिंगद्वारे विश्लेषण केले गेले.
सी-टर्मिनल अॅमिडेशन (LHDALDAK-CONH2) सह हिस्टिडाइन असलेले सिंथेटिक पेप्टाइड जवळच्या पेप्टाइड-आधारित इन विट्रो लेबलिंगचे विश्लेषण करण्यासाठी वापरले गेले.या परीक्षणात, 100 μM शुद्ध केलेले miniSOG, 10 mM प्रोब 3 आणि 2 μg/ml सिंथेटिक पेप्टाइड PBS मध्ये 50 μl च्या एकूण प्रतिक्रिया व्हॉल्यूममध्ये मिसळले गेले.प्रतिक्रियेचे मिश्रण खोलीच्या तपमानावर 1 तासासाठी निळ्या एलईडी लाइटने विकिरणित केले गेले.LC-MS प्रणाली (Waters, SYNAPT XS Ions मोबिलिटी टाइम-ऑफ-फ्लाइट मास स्पेक्ट्रोमीटर MassLynx स्पेक्ट्रम विश्लेषण सॉफ्टवेअरसह) वापरून एका मायक्रोलिटर नमुन्याचे विश्लेषण केले गेले.
HEK293T पेशी स्थिरपणे miniSOG फ्यूजन जनुक व्यक्त करणार्‍या वेगवेगळ्या ऑर्गेनेल लोकॅलायझेशन (Mito, ER, न्यूक्लियस) आणि पार्किन-miniSOG आणि BRD4-miniSOG लाईन्ससाठी 15 सेमी डिशेसमध्ये 10 सेमी डिशेसमध्ये सीड केल्या गेल्या.~90% संगमावर पोहोचल्यावर, पेशी HBSS सह एकदा धुतल्या गेल्या, नंतर HBSS मध्ये प्रोब 3 सह 1 तास 37°C तापमानावर उष्मायन केले आणि खोलीच्या तापमानावर 10 W निळ्या एलईडीने प्रकाशित केले.पार्किनच्या गैर-संपर्क लेबलिंगसाठी, HBSS मध्ये प्रोब 3 सह 10 μM प्रोटॉन कार्बोनिल सायनाइड वाहक एम-क्लोरोफेनिलहायड्राझोन CCCP (Solarbio, #C6700) 1 तासासाठी 37°C वर जोडले गेले.सेल लिसिस, क्लिक केमिस्ट्री, रिडक्शन आणि अल्किलेशन टप्पे वर वर्णन केल्याप्रमाणेच होते, त्याशिवाय 2 मिलीग्राम लायसेट जोडले गेले आणि फोटोडिग्रेडेबल बायोटिन अझाइडऐवजी बायोटिन PEG3 अॅझाइड क्लिक रिअॅक्शनमध्ये वापरले गेले.संवर्धनानंतर, मणी 0.2% एसडीएस असलेल्या 5 मिली पीबीएसने 3 वेळा, 1 एम यूरिया असलेल्या 5 मिली पीबीएसने 3 वेळा आणि 5 मिली पीबीएससह 3 वेळा धुतले गेले.त्यानंतर, 300 μl 25 mM ABC मध्ये 2 µg ट्रिप्सिन जोडले गेले ज्यामध्ये 1 M युरिया 37°C तापमानावर रात्रभर प्रथिने काढून टाकण्यात आले.2-3 pH पर्यंत पोहोचेपर्यंत फॉर्मिक ऍसिड जोडून प्रतिक्रिया थांबविली गेली.मणीवर ट्रायप्सिनायझेशन केल्यानंतर, पेप्टाइड द्रावण SOLAµ HRP स्तंभ (थर्मो, #60209-001) वापरून काढून टाकण्यात आले आणि स्पीडव्हॅक व्हॅक्यूम कॉन्सन्ट्रेटरमध्ये वाळवले.पेप्टाइड्स 0.1% फॉर्मिक ऍसिडमध्ये पुन्हा विरघळले गेले आणि वर वर्णन केलेल्या नॅनो-ESI स्त्रोतासह सुसज्ज ऑर्बिट्रॅप फ्यूजन ल्युमोस ट्रायब्रिड मास स्पेक्ट्रोमीटर वापरून 500 एनजी पेप्टाइड्सचे विश्लेषण केले गेले.पेप्टाइड्स व्यावसायिक RP-HPLC प्रीकॉलम्स (75 μm x 2 cm) (थर्मो, क्र. 164946) आणि विश्लेषणात्मक RP-HPLC कॉलम्स (75 μm x 25 सेमी) (थर्मो, क्र. 164941) वर विभक्त केले गेले होते, दोन्ही 2 μm ने भरलेले होते.60 मिनिटांत 8% ते 35% ACN पर्यंत ग्रेडियंट, नंतर 300 Nl/min च्या प्रवाह दराने 6 मिनिटांत रेखीयरीत्या 98% B पर्यंत वाढले.MS स्पेक्ट्रा (350-1500 m/z) 60,000 च्या रिझोल्यूशनसह, AGC 4 × 105, आणि 50 ms च्या जास्तीत जास्त इनपुट वेळेसह गोळा केले गेले.निवडलेले आयन अनुक्रमे 3 s चक्रांमध्ये HCD द्वारे 30% च्या सामान्यीकृत टक्कर उर्जेसह खंडित केले गेले, 1.6 m/z ची क्वाड्रपोल आयसोलेशन विंडो आणि 15000 रिझोल्यूशन. एक 5 × 104 टेंडम मास स्पेक्ट्रोमीटर AGC लक्ष्य आणि जास्तीत जास्त इंजेक्शन वेळ 22 एमएस वापरले होते.डायनॅमिक अपवर्जन 45 सेकंदांवर सेट केले आहे. MS/MS साठी नियुक्त न केलेले आयन किंवा 1+ आणि >7+ शुल्क असलेले आयन नाकारले गेले. MS/MS साठी नियुक्त न केलेले आयन किंवा 1+ आणि >7+ शुल्क असलेले आयन नाकारले गेले. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ आणि >7+ были отклонены для МС/МС. MS/MS साठी 1+ आणि >7+ च्या शुल्कासह असाइन न केलेले आयन किंवा आयन नाकारले गेले.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ आणि >7+ были отклонены для МС/МС. MS/MS साठी 1+ आणि >7+ चे शुल्क असलेले अनिर्दिष्ट आयन किंवा आयन नाकारले गेले.
NeutrAvidin मण्यांच्या संवर्धनापर्यंत नमुना तयार करण्याचे टप्पे वर वर्णन केलेल्या LC-MS/MS विश्लेषणाप्रमाणेच होते.लोडिंग कंट्रोलसाठी इनपुट म्हणून अंदाजे 50 μg lysate वापरले गेले आणि 2 mg lysate क्लिक प्रतिक्रियांसाठी वापरले गेले.न्युट्राविडिनने संवर्धन आणि धुतल्यानंतर, अॅग्रोज राळ मण्यांमध्ये 50 μl लेम्मली बफर घालून आणि 5 मिनिटे 95 डिग्री सेल्सिअसवर उकळून बांधलेली प्रथिने कमी केली गेली.कंट्रोल लोड इनपुट आणि बीड समृद्ध नमुने SDS-PAGE द्वारे विश्लेषित केले गेले आणि मानक वेस्टर्न ब्लॉट पद्धतींद्वारे PVDF झिल्ली (मिलीपूर, #ISEQ00010) मध्ये हस्तांतरित केले गेले.0.1% tween-20 (TBST) असलेल्या TBS मध्ये 5% स्किम मिल्क (Sangon, #A600669) सह पडदा अवरोधित केला गेला आणि प्राथमिक आणि दुय्यम प्रतिपिंडांसह अनुक्रमे उष्मायन केले गेले.प्राथमिक अँटीबॉडीज TBST मध्ये 5% स्किम मिल्कमध्ये 1:1000 पातळ केले गेले आणि 4°C तापमानावर रात्रभर उबवले गेले.दुय्यम प्रतिपिंडांचा वापर 1:5000 च्या प्रमाणात केला गेला आणि खोलीच्या तपमानावर 1 तास उष्मायन केले गेले.केमिडॉक एमपी इमेजिंग सिस्टमचा वापर करून केमिल्युमिनेसेन्सद्वारे पडदा दृश्यमान करण्यात आला.आकृतीमध्ये ब्लॉट्स आणि जेलचे सर्व न कापलेले स्कॅन कच्चा डेटा म्हणून सादर केले आहेत.
या अभ्यासात वापरलेल्या प्राथमिक प्रतिपिंडांमध्ये ससा विरोधी SFPQ मोनोक्लोनल प्रतिपिंड (CST, क्रमांक 71992), ससा विरोधी FUS मोनोक्लोनल प्रतिपिंड (CST, क्रमांक 67840), ससा विरोधी NSUN2 पॉलीक्लोनल प्रतिपिंड (प्रोटीनटेक, क्रमांक 20854-1-) यांचा समावेश आहे. AP), ससा अँटी-mSin3A पॉलीक्लोनल अँटीबॉडी (Abcam, #ab3479), माउस अँटी-टॅग मोनोक्लोनल अँटीबॉडी (TransGen, #HT201-02), माउस अँटी-β-actin मोनोक्लोनल अँटीबॉडी (TransGen, #HC201-01), ससा अँटीबॉडी -CDK2 मोनोक्लोनल प्रतिपिंड (ABclonal, #A0094), ससा मोनोक्लोनल प्रतिपिंड ते CTBP1 (ABclonal, #A11600), ससा पॉलीक्लोनल प्रतिपिंड ते DUT (ABclonal, #A2901), ससा पॉलीक्लोनल प्रतिपिंड ते PSMC4 (ABclonal, #A2505), ससा पॉलीक्लोनल प्रतिपिंड DNAJB1 पॉलीक्लोनल अँटीबॉडी (ABclonal, # A5504).या प्रतिपिंडांचा वापर TBST मध्ये 5% स्किम दुधात 1:1000 च्या प्रमाणात केला गेला.या अभ्यासात वापरल्या जाणार्‍या दुय्यम प्रतिपिंडांमध्ये 1:5000 डायल्युशनमध्ये अँटी-रॅबिट IgG (TransGen, #HS101-01), अँटी-माउस IgG (TransGen, #HS201-01) समाविष्ट होते.
BRD4 SFPQ शी संवाद साधतो की नाही हे तपासण्यासाठी, स्थिर HEK293T आणि HEK293T ओव्हरएक्सप्रेस करणार्‍या BRD4-miniSOG पेशी 10 सेमी डिशेसमध्ये प्लेट केल्या होत्या.कोल्ड पीबीएसने सेल धुतले गेले आणि 1 मिली पिअर्स आयपी लिसिस बफर (थर्मो फिशर, #87787) मध्ये EDTA-मुक्त प्रोटीज इनहिबिटरसह 4°C तापमानात 30 मिनिटांसाठी लाइज केले गेले.त्यानंतर, लायसेट्स 1.5 मिली सेंट्रीफ्यूज ट्यूबमध्ये गोळा केले गेले आणि 15,871 xg वर 4°C तापमानावर 10 मिनिटांसाठी सेंट्रीफ्यूज केले गेले.सुपरनॅटंटची कापणी केली गेली आणि 5 µg अँटी-V5 लेबल असलेल्या माउस मोनोक्लोनल अँटीबॉडी (CST, #80076) रात्रभर 4°C तापमानात उबवले गेले.अंदाजे 50 μl प्रथिने A/G चुंबकीय मणी (MCE, #HY-K0202) 0.5% Tween-20 असलेल्या PBS सह दोनदा धुवा.नंतर सेल लाइसेट्स चुंबकीय मण्यांनी 4 तास 4 डिग्री सेल्सिअस तापमानात तळापासून वरच्या दिशेने फिरत होते.नंतर मणी 1 मिली पीबीएसटी बफरने चार वेळा धुवून 95 डिग्री सेल्सिअस तापमानात 5 मिनिटांसाठी उकळले.SDS-PAGE gels वर नमुने विश्लेषित केले गेले आणि मानक पाश्चात्य ब्लॉट पद्धती वापरून PVDF मेम्ब्रेनमध्ये हस्तांतरित केले गेले.TBST मध्ये 5% स्किम मिल्कमध्ये पडदा अवरोधित केला गेला आणि प्राथमिक आणि दुय्यम प्रतिपिंडांसह अनुक्रमे उष्मायन केले गेले.प्राइमरी अँटीबॉडी रॅबिट अँटी-SFPQ मोनोक्लोनल अँटीबॉडी (CST, #71992) TBST मध्ये 5% स्किम मिल्कमध्ये 1:1000 च्या प्रमाणात वापरण्यात आली आणि रात्रभर 4°C वर उष्मायन केले गेले.अँटी-रेबिट IgG 1:5000 च्या प्रमाणात वापरला गेला आणि खोलीच्या तपमानावर 1 तास उष्मायन केले गेले.केमिडॉक एमपी इमेजिंग सिस्टमचा वापर करून केमिल्युमिनेसेन्सद्वारे पडदा दृश्यमान करण्यात आला.
सॉल्व्हेंट ऍक्सेसिबल सरफेस एरिया (SASA) विश्लेषणासाठी वापरल्या जाणार्‍या सर्व स्ट्रक्चर्स प्रोटीन डेटा बँक (PDB)52 किंवा अल्फाफोल्ड प्रोटीन स्ट्रक्चर डेटाबेस53 मधून प्राप्त केल्या गेल्या.FreeSASA प्रोग्राम वापरून प्रत्येक अवशेषांसाठी परिपूर्ण SASA ची गणना केली गेली.लेबल केलेल्या हिस्टिडाइन आणि त्याच्या शेजाऱ्यांसाठी फक्त संपूर्ण आणि अस्पष्ट SASA डेटा प्रत्येक संरचनेसाठी सरासरी SASA प्राप्त करण्यासाठी वापरला गेला.प्रत्येक हिस्टिडाइनसाठी सापेक्ष सॉल्व्हेंट ऍक्सेसिबिलिटी (RSA) ची गणना सॉल्व्हेंटसाठी उपलब्ध असलेल्या प्रायोगिक जास्तीत जास्त संभाव्य अवशेष पृष्ठभागाच्या क्षेत्राद्वारे परिपूर्ण SASA मूल्य विभाजित करून केली गेली.मध्य RSA 20% पेक्षा कमी असल्यास सर्व हिस्टिडाईन्सचे नंतर लपविलेले म्हणून वर्गीकरण केले गेले, अन्यथा उघड ५६.
डीडीए मोडमध्ये मिळालेल्या कच्च्या फायली प्रोटीओम डिस्कवरर (v2.5) किंवा MSfragger (Fragpipe v15.0) वापरून योग्य स्विसप्रॉट सत्यापित प्रोटीन डेटाबेसमध्ये सामान्य दूषित घटकांचा वापर करून शोधल्या गेल्या.पेप्टाइड्सना दोन गहाळ क्लीवेज साइट्ससह संपूर्ण ट्रिप्सिन आवश्यक होते, कार्बामॉयल मेथिलेशन एक निश्चित बदल आणि डायनॅमिक फेरबदल म्हणून मेथिओनाइन ऑक्सिडेशन.प्रिकर्सर आणि फ्रॅगमेंट वेट टॉलरन्स अनुक्रमे 10 ppm आणि 0.02 Da (MS2 Orbitrap) वर सेट केले होते. दूषित हिट काढून टाकण्यात आले आणि <1% खोटे शोध दर मिळविण्यासाठी प्रथिने फिल्टर केली गेली. दूषित हिट काढून टाकण्यात आले आणि <1% खोटे शोध दर मिळविण्यासाठी प्रथिने फिल्टर केली गेली. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэфициент ложного %. दूषित हिट काढून टाकण्यात आले आणि <1% खोटे शोध दर देण्यासाठी प्रथिने फिल्टर केली गेली.去除污染物命中,过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率. <1%的错误发现率. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижения уровня ложных обнаружений%. दूषित हिट काढून टाकले गेले आणि <1% खोटे सकारात्मक दर प्राप्त करण्यासाठी प्रथिने फिल्टर केली गेली.लेबले न वापरता परिमाणात्मक विश्लेषणासाठी, तीन जैविक पुनरावृत्तींमधून सामान्यीकृत प्रथिने सामग्री वापरली गेली.प्रोटीन सबसेल्युलर लोकॅलायझेशन विश्लेषण DAVID बायोइन्फॉरमॅटिक्स रिसोर्सेस, मिटोकार्टा 3.0 मधील जीन ऑन्टोलॉजी (GO) विश्लेषण आणि अॅलिस टिंग ग्रुपद्वारे संकलित आणि प्रकाशित डेटाबेस वापरून केले गेले.पर्सियस (v1.6.15.0) कडून ज्वालामुखीचा नकाशा प्राप्त झाला. प्रथिने विपुलता पट बदलांची संख्यात्मक महत्त्वासाठी द्वि-पक्षीय टी-चाचणी वापरून चाचणी केली गेली आणि प्रथिने हिट विपुलता बदल >2 (अन्यथा नमूद केल्याशिवाय) आणि p मूल्य <0.05 सह ओळखले गेले. प्रथिने विपुलता पट बदलांची संख्यात्मक महत्त्वासाठी द्वि-पक्षीय टी-चाचणी वापरून चाचणी केली गेली आणि प्रथिने हिट विपुलता बदल >2 (अन्यथा नमूद केल्याशिवाय) आणि p मूल्य <0.05 सह ओळखले गेले. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. दोन-पुच्छ टी-चाचणी वापरून सांख्यिकीय महत्त्वासाठी प्रथिने सामग्रीच्या पट बदलांची चाचणी घेण्यात आली आणि प्रथिने जुळणी सामग्री बदल >2 (अन्यथा नमूद केल्याशिवाय) आणि एपी मूल्य <0.05 सह ओळखले गेले..使用 双边 t 检验 检验 测试 蛋白质 倍 数 的 的 统计 显着性 并 确定 命 中 的 变化 变化> 2 （另 有 说明） 和 和 पी 值 <0.05 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. प्रथिने सामग्रीमधील पट बदलांचे सांख्यिकीय महत्त्व दोन-पुच्छ टी-टेस्ट वापरून तपासले गेले आणि प्रथिने जुळण्या सामग्री बदलांसाठी निर्धारित केल्या गेल्या >2 (अन्यथा सूचित केल्याशिवाय) आणि p-मूल्ये <0.05.स्ट्रिंग डेटाबेससह GO विश्लेषण वापरून प्रोटीन परस्परसंवाद विश्लेषण केले गेले.
समान परिणामांसह तीन जैविक प्रतिकृती केल्या गेल्या.ग्राफपॅड प्रिझम (ग्राफपॅड सॉफ्टवेअर) सह सांख्यिकीय विश्लेषण केले गेले आणि पर्सियस (v1.6.15.0) सह ज्वालामुखी प्लॉट तयार केले गेले.दोन गटांची तुलना करण्यासाठी, दोन-पुच्छ विद्यार्थ्यांची टी-चाचणी वापरून p-मूल्ये निर्धारित केली गेली.प्रायोगिक गटात किमान दोनदा ओळखल्या गेलेल्या सिंगलटन प्रथिने ज्वालामुखी प्लॉटमध्ये समाविष्ट केल्या गेल्या आणि नियंत्रण गटातील संबंधित गहाळ मूल्ये सामान्य वितरणातून पर्सियससह बदलण्यात आली जेणेकरून p-मूल्याची गणना करता येईल.त्रुटी पट्ट्या सरासरी ± मानक विचलन दर्शवतात.सांख्यिकीय विश्लेषणासाठी प्रोटीओमिक विश्लेषणांमध्ये, कमीतकमी दोन जैविक प्रतिकृतींमध्ये दिसणाऱ्या प्रथिनांची विपुलता राखून ठेवली गेली.नमुना आकार पूर्व-निर्धारित करण्यासाठी सांख्यिकीय पद्धती वापरल्या गेल्या नाहीत.प्रयोग यादृच्छिक नाहीत.प्रयोग आणि परिणामांचे मूल्यमापन करताना संशोधकांनी केलेल्या कामांकडे डोळेझाक नव्हती.
अभ्यासाच्या रचनेबद्दल अधिक माहितीसाठी, या लेखाशी जोडलेला निसर्ग संशोधन अहवाल गोषवारा पहा.
या अभ्यासात प्राप्त केलेला मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा डेटासेट ID PXD034811 (PDPL-MS डेटासेट) अंतर्गत iProX57 भागीदार भांडाराद्वारे ProteomeXchange Consortium ला सबमिट केला गेला.कच्चा डेटा रॉ डेटा फाइल्सच्या स्वरूपात प्रदान केला जातो.हा लेख मूळ डेटा प्रदान करतो.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. अतिपरिचित क्षेत्र जाणून घेणे: प्रथिने कॉम्प्लेक्स आणि मॅप ऑर्गेनेल्स वैशिष्ट्यीकृत करण्यासाठी प्रॉक्सिमिटी-डिपेंडेंट बायोटिनाइलेशन वापरणे. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. अतिपरिचित क्षेत्र जाणून घेणे: प्रथिने कॉम्प्लेक्स आणि मॅप ऑर्गेनेल्स वैशिष्ट्यीकृत करण्यासाठी प्रॉक्सिमिटी-डिपेंडेंट बायोटिनाइलेशन वापरणे.Gingras, AS, Abe, KT आणि Raut, B. सभोवतालची ओळख: प्रथिने कॉम्प्लेक्स आणि मॅप ऑर्गेनेल्स वैशिष्ट्यीकृत करण्यासाठी प्रॉक्सिमिटी-डिपेंडेंट बायोटिनाइलेशन वापरणे. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. अतिपरिचित क्षेत्र समजून घेणे: शेजारचे जैविक जीवनावरील अवलंबित्व वापरा.Gingras, AS, Abe, KT आणि Raut, B. समीपता समजून घेणे: प्रथिने कॉम्प्लेक्सचे वैशिष्ट्य आणि निकटता-आश्रित बायोटिनिलेशन वापरून ऑर्गेनेल्सचे मॅपिंग.चालू.माझे मत.रासायनिक.जीवशास्त्र 48, 44–54 (2019).
गेरी, जेबी इत्यादी.डेक्सटर ऊर्जा रोगप्रतिकारक पेशींमध्ये हस्तांतरित करून सूक्ष्म पर्यावरण मॅपिंग.विज्ञान 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL et al.दोन-प्रोटीओम स्केल नेटवर्क मानवी संवादाचे सेल-विशिष्ट रीमॉडेलिंग शोधतात.सेल 184, 3022–3040.e3028 (2021).