बातम्या

Nature.com ला भेट दिल्याबद्दल धन्यवाद.तुम्ही वापरत असलेल्या ब्राउझर आवृत्तीमध्ये मर्यादित CSS सपोर्ट आहे.सर्वोत्तम अनुभवासाठी, आम्ही शिफारस करतो की तुम्ही अद्ययावत ब्राउझर वापरा (किंवा इंटरनेट एक्सप्लोररमध्ये सुसंगतता मोड अक्षम करा).दरम्यान, सतत समर्थन सुनिश्चित करण्यासाठी, आम्ही साइटला शैली आणि JavaScript शिवाय रेंडर करू.
कर्करोगाच्या पेशींनी सेल्युलर तणावावर मात करण्यासाठी आणि प्रगती सुरू ठेवण्यासाठी विविध यंत्रणा विकसित केल्या आहेत.प्रोटीन किनेस आर (पीकेआर) आणि त्याचे प्रोटीन अॅक्टिव्हेटर (पीएसीटी) हे प्रारंभिक प्रतिसादकर्ते आहेत जे सेल प्रसार आणि अपोप्टोसिस प्रतिबंधित करणारे विविध तणाव सिग्नलचे निरीक्षण करतात.तथापि, कर्करोगाच्या पेशींमध्ये PACT-PKR मार्गाचे नियमन मुख्यत्वे अज्ञात आहे.येथे, आम्हाला आढळले की लांब नॉन-कोडिंग RNA (lncRNA) aspartyl tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) थेट PACT-PKR मार्गाच्या प्रतिबंधात सामील आहे आणि कर्करोगाच्या पेशींच्या प्रसारास प्रोत्साहन देते.CRISPRi 971 कर्करोग-संबंधित lncRNA ची मोठ्या प्रमाणात कार्यात्मक स्क्रीनिंग वापरून, आम्हाला आढळले की DARS-AS1 लक्षणीय वर्धित कर्करोगाच्या पेशींच्या प्रसाराशी संबंधित आहे.म्हणून, DARS-AS1 नॉकआउट सेलच्या प्रसारास प्रतिबंध करते आणि विट्रोमधील विविध कर्करोगाच्या पेशींमध्ये कर्करोगाच्या सेल ऍपोप्टोसिसला प्रोत्साहन देते आणि विवोमध्ये ट्यूमरची वाढ लक्षणीयरीत्या कमी करते.यांत्रिकरित्या, DARS-AS1 थेट PACT सक्रियकरण डोमेनशी जोडते आणि PACT-PKR परस्परसंवाद प्रतिबंधित करते, ज्यामुळे PKR सक्रियकरण, eIF2α फॉस्फोरिलेशन कमी होते आणि अपोप्टोटिक सेल मृत्यू रोखते.वैद्यकीयदृष्ट्या, DARS-AS1 हे बहुविध कर्करोगांमध्ये मोठ्या प्रमाणावर व्यक्त केले जाते आणि या lncRNA ची जास्त एक्सप्रेशन खराब रोगनिदान दर्शवते.हा अभ्यास DARS-AS1 lncRNA द्वारे PACT-PKR मार्गाचे कर्करोग-विशिष्ट नियमन स्पष्ट करतो आणि कर्करोगाचे निदान आणि उपचारांसाठी आणखी एक लक्ष्य प्रदान करतो.
तणावाशी जुळवून घेण्याची क्षमता हे कर्करोगाच्या पेशींचे अस्तित्व आणि प्रसाराचे एक महत्त्वाचे वैशिष्ट्य आहे.कर्क सूक्ष्म वातावरणात कर्करोगाचा वेगवान प्रसार आणि चयापचय चिन्हे - पोषक तत्वांची कमतरता, हायपोक्सिया आणि कमी pH - जे सेल मृत्यू सिग्नलिंग मार्ग ट्रिगर करू शकतात.p535, उष्मा शॉक प्रथिने 6, 7, KRAS8, 9, आणि HIF-110, 11, 12, 13 सारख्या तणाव-संवेदनशील जनुकांचे अनियमन कर्करोगात वारंवार दिसून येते, ज्यामुळे ऍपोप्टोसिस अवरोधित होते आणि जगण्याची चालना मिळते.
प्रोटीन किनेज R (PKR) हा युकेरियोटिक इनिशिएशन फॅक्टर 2α (eIF2α) चा एक महत्त्वाचा स्ट्रेस सेन्सर आणि सबयुनिट किनेज आहे, जो सेल्युलर स्ट्रेसचा सेल डेथशी संबंध जोडणारा ट्रान्सलेशनल रेग्युलेटर आहे.परदेशी डबल-स्ट्रँडेड RNA (dsRNA) द्वारे PKR ला मूळतः अँटीव्हायरल प्रोटीन म्हणून ओळखले गेले.सक्रिय झाल्यावर, विषाणू आणि सेल्युलर प्रोटीन संश्लेषण14,15,16 प्रतिबंधित करण्यासाठी PKR फॉस्फोरिलेट्स eIF2α.dsRNA17,18,19,20,21,22,23 च्या अनुपस्थितीत PACT (PKR एक्टिवेटर प्रोटीन) हे पहिले PKR एक्टिवेटर प्रोटीन म्हणून ओळखले गेले आहे.PKR शी थेट संवादाद्वारे, PACT विविध तणाव (सीरम उपासमार, पेरोक्साईड किंवा आर्सेनाइट उपचार) PKR आणि डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग मार्गांमध्ये बदलते.eIF2α फॉस्फोरिलेशन व्यतिरिक्त, PACT-मध्यस्थ PKR सक्रियकरण तणावाच्या प्रतिसादाशी संबंधित विविध घटनांना चालना देते, ज्यात PI3K/Akt24 मार्गाद्वारे बदललेली रेडॉक्स स्थिती, p5325,26 द्वारे वर्धित DNA नुकसान तपासणी आणि NF-κB27,28 लिप्यंतरण, 29 नियंत्रित करते. ताण प्रतिसाद, प्रसार, ऍपोप्टोसिस आणि इतर प्रमुख सेल्युलर प्रक्रियांमध्ये त्यांची महत्त्वपूर्ण भूमिका लक्षात घेता, PKR आणि PACT अनेक रोगांसाठी, विशेषतः कर्करोग30,31,32,33 साठी आशावादी उपचारात्मक लक्ष्ये आहेत.तथापि, हे प्लीओट्रॉपिक कार्यात्मक आणि जैविक महत्त्व असूनही, कर्करोगाच्या पेशींमध्ये PACT/PKR क्रियाकलापांचे नियमन मायावी राहते.
lncRNA हे प्रोटीन-कोडिंग क्षमता नसलेल्या 200 न्यूक्लियोटाइड्सपेक्षा मोठे प्रतिलेख आहेत.अत्याधुनिक संपूर्ण जीनोम सिक्वेन्सिंग प्रकल्पांनी हजारो lncRNAs ओळखले असल्याने, त्यांची जैविक कार्ये स्पष्ट करण्यासाठी खूप प्रयत्न केले गेले आहेत.संशोधनाच्या वाढत्या भागाने हे दाखवून दिले आहे की lncRNA अनेक जैविक प्रक्रियांमध्ये गुंतलेले आहेत 37 ज्यामध्ये X-क्रोमोसोम निष्क्रियतेचे नियमन 38,39, छापणे40, ट्रान्सक्रिप्शन41,42, भाषांतर43 आणि अगदी कर्करोगाची वाढ 44,45,46,47 यांचा समावेश आहे.या अभ्यासांनी नोंदवले आहे की अनेक lncRNAs PACT/PKR मार्गामध्ये गुंतलेले आहेत.अशाच एका अभ्यासात असे दिसून आले की lncRNA ASPACT ने PACT लिप्यंतरण प्रतिबंधित केले आणि PACT mRNA ची आण्विक धारणा वाढवली.इतर अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की lncRNA nc886 PKR ला जोडते आणि त्याचे फॉस्फोरिलेशन 49,50 प्रतिबंधित करते.आतापर्यंत, PACT-मध्यस्थ PKR सक्रियकरणाचे नियमन करणारे lncRNA नोंदवले गेले नाही.
Aspartyl-tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) ची ओळख ऑन्कोजेनिक lncRNA51,52,53,54 म्हणून करण्यात आली आहे.miP-194-5p53, miP-12952 आणि miP-532-3p51 च्या नियमनाद्वारे, DARS-AS1 हे अनुक्रमे क्लिअर सेल रेनल सेल कार्सिनोमा, थायरॉईड कार्सिनोमा आणि नॉन-स्मॉल सेल लंग कार्सिनोमाच्या वाढीस चालना देत असल्याचे दिसून आले आहे.टोंग आणि सहकाऱ्यांना असेही आढळून आले की DARS-AS1 प्रोटीन 39 (RBM39) RNA-बाइंडिंग स्वरूपाची स्थिरता राखून मायलोमाच्या प्रगतीला प्रोत्साहन देते.तथापि, हे lncRNA PACT-PKR सक्रियकरण आणि कर्करोगाच्या पेशींच्या ताण प्रतिसादाच्या नियमनात सामील आहे की नाही यावर कोणतेही अभ्यास केले गेले नाहीत.
येथे, आम्ही CRISPRi प्रणालीचा वापर करून मोठ्या प्रमाणात नुकसान-ऑफ-फंक्शन स्क्रीन केली आणि निर्धारित केले की DARS-AS1 lncRNA अनेक प्रकारच्या कर्करोगाच्या पेशींच्या प्रसारास प्रोत्साहन देते.याव्यतिरिक्त, आम्ही एक प्रमुख यंत्रणा ओळखली आहे: DARS-AS1 थेट PACT ला जोडते, PACT आणि PKR बंधन प्रतिबंधित करते, eIF2α चे फॉस्फोरिलेशन प्रतिबंधित करते, कमी PKR सब्सट्रेट, आणि शेवटी अपोप्टोटिक सेल मृत्यू रोखते.शेवटी, आमचे कार्य DARS-AS1 lncRNA हे PACT-PKR मार्गाचे नियामक आणि कर्करोग उपचार आणि रोगनिदानासाठी संभाव्य लक्ष्य असल्याचे प्रकट करते.
विस्तृत जीनोमिक प्रोफाइलिंग अभ्यासाने कर्करोगाशी संबंधित शेकडो lncRNAs ओळखले आहेत.तथापि, त्यांचे कार्य मोठ्या प्रमाणात अज्ञात आहे56.कर्करोगाच्या प्रगतीमध्ये सामील असलेल्या आशादायक lncRNA उमेदवारांना ओळखण्यासाठी, आम्ही CRISPRi प्रणाली (Fig. 1a) वापरून SW620 कोलोरेक्टल कॅन्सर सेल लाईनमध्ये कमी प्रसारासाठी नुकसान-ऑफ-फंक्शन स्क्रीन केली.SW480 आणि SW620 कोलन कॅन्सर सेल लाइन्सचे वैशिष्ट्य म्हणजे ते एकाच रुग्णाच्या प्राथमिक आणि दुय्यम ट्यूमरमधून तयार होतात.प्रगत कोलन कर्करोगाच्या प्रगतीमध्ये अनुवांशिक बदलांचा अभ्यास करण्यासाठी हे एक मौल्यवान तुलना प्रदान करते.म्हणून, आम्ही RNA अनुक्रम वापरून कोलोरेक्टल कॅन्सर सेल लाइन्स (SW480 आणि SW620) च्या ट्रान्सक्रिप्टोम्सचे विश्लेषण केले आणि प्रकाशित साहित्यातून काही संभाव्य कार्यात्मक lncRNA गोळा केले.या परिणामांच्या आधारे, आम्ही 7355 sgRNA लायब्ररीची रचना केली आहे ज्यामध्ये 971 कर्करोगाशी संबंधित lncRNAs आणि नकारात्मक नियंत्रणासाठी 500 अनलक्षित sgRNA oligos (पूरक डेटा 1) आहेत.
CRISPRi प्रणाली वापरून स्क्रीनिंगचे योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व.b स्क्रीनिंग नंतर sgRNA संवर्धन.क्षैतिज ठिपके असलेली रेषा लॉग2 (फोल्ड चेंज) = ±0.58 दर्शवते.अनुलंब ठिपके असलेली रेषा p मूल्य = 0.05 दर्शवते.काळे ठिपके गैर-लक्ष्य sgRNA (NC म्हणून नियुक्त) दर्शवतात.लाल ठिपके DARS-AS1 ला लक्ष्य करणारे sgRNA आहेत.निळे ठिपके LINC00205 ला लक्ष्य करणारे sgRNA आहेत, पूर्वी वर्णन केलेले ऑन्कोजेनिक lncRNA.पट बदल = (सामान्य वाचन, दिवस 17)/(सामान्य वाचन, दिवस 0).c DARS-AS1 sgRNA नॉकडाउन सेल वाढ प्रतिबंधित करते.एरर बार तीन प्रयोगांचे ± मानक विचलन दर्शवतात.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01 दोन-पुच्छ विद्यार्थ्याची टी-चाचणी.d DARS-AS1 ट्यूमरमधील अभिव्यक्ती (TCGA डेटासेट).bLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP, आणि COAD, अनुक्रमे (TCGA डेटासेट) असलेल्या रूग्णांकडून जोडलेल्या सामान्य आणि ट्यूमरच्या नमुन्यांमध्ये DARS-AS1 ची अभिव्यक्ती.पी-मूल्ये जोडलेल्या दोन-पुच्छ विद्यार्थ्यांची टी-चाचणी वापरून प्राप्त केली गेली.
प्लाझमिड तयार केल्यानंतर आणि लेन्टीव्हायरसचे पॅकेजिंग केल्यानंतर, आम्ही वरील लायब्ररीसह dCas9-SW620 कोलोरेक्टल कॅन्सर सेल लाइन चार स्वतंत्र संक्रमण प्रयोगांमध्ये बदलली.या संक्रमणांसाठी बहुगुणित संक्रमण (MOI) 0.1-0.3 होते, जे सूचित करते की प्रत्येक पेशी केवळ एका sgRNA ने संक्रमित केली जाऊ शकते.18 दिवसांच्या इन विट्रो कल्चरनंतर, स्क्रिनिंगनंतर लक्ष्य sgRNA चे संवर्धन प्रोफाइल कमी झाले किंवा वाढले, तर नॉन-लक्षित नियंत्रण ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्सची संख्या प्री-स्क्रीनिंग प्रोफाइलच्या तुलनेत तुलनेने अपरिवर्तित राहिली, हे दर्शविते की आमचे लक्ष्य उच्च स्क्रीन-विशिष्ट आहे. लायब्ररीतांदूळ.1b आणि पूरक तक्ता 1). LINC00205, फुफ्फुसाचा कर्करोग आणि यकृताच्या कर्करोगाच्या प्रगतीला प्रोत्साहन देण्यासाठी 58,59,60 पूर्वी नोंदवले गेले होते, या स्क्रीनिंगच्या विश्वासार्हतेची पुष्टी करणारे (लॉग2 (फोल्ड चेंज) < −0.58, p मूल्य < 0.05) तपासले गेले (चित्र 1b). LINC00205, फुफ्फुसाचा कर्करोग आणि यकृताच्या कर्करोगाच्या प्रगतीला प्रोत्साहन देण्यासाठी 58,59,60 पूर्वी नोंदवले गेले होते, या स्क्रीनिंगच्या विश्वासार्हतेची पुष्टी करणारे (लॉग2 (फोल्ड चेंज) < −0.58, p मूल्य < 0.05) तपासले गेले (चित्र 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1ब). LINC00205, पूर्वी फुफ्फुसाचा कर्करोग आणि यकृत कर्करोगाच्या प्रगतीला प्रोत्साहन देण्यासाठी नोंदवले गेले होते 58,59,60, वगळण्यात आले होते (लॉग2 (फोल्ड चेंज) <-0.58, p-व्हॅल्यू <0.05), या स्क्रीनिंगच्या मजबूततेची पुष्टी करते (चित्र .1b) . LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）< -0.58，p 值< 0.05），证实了该筛选的可靠性（图1b）。 LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）< -0.58，p 值< 0.05），证实了该筛选的可靠性（图1b）。 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1ब). LINC00205, पूर्वी फुफ्फुस आणि यकृताच्या कर्करोगाच्या प्रगतीला प्रोत्साहन देण्यासाठी अहवाल दिला होता58,59,60, वगळण्यात आला होता (लॉग2 (फोल्ड चेंज) <-0.58, p-व्हॅल्यू <0.05), या स्क्रीनिंगच्या मजबूततेची पुष्टी करणारा (चित्र .1b).
चाचणी केलेल्या सर्व lncRNA पैकी, DARS-AS1 ची देखील तपासणी करण्यात आली, तीन कॉग्नेट sgRNA oligonucleotides 18 दिवसांच्या संवर्धनानंतर लक्षणीयरीत्या कमी झाले, असे सूचित करते की या lncRNA च्या नॉकडाउनमुळे कर्करोगाचा प्रसार कमी झाला (चित्र 1b).या परिणामाला कोलोरेक्टल कर्करोगाच्या पेशींमध्ये MTS विश्लेषणाद्वारे आणखी समर्थन मिळाले जे दर्शविते की DARS-AS1 नॉकडाउन पेशींचा वाढीचा दर नियंत्रण पेशींच्या (आकृती 1c) तुलनेत केवळ निम्मा होता आणि इतर अनेक कर्करोग प्रकारांच्या मागील अहवालांशी सुसंगत होता.: स्पष्ट सेल किडनी कर्करोग, थायरॉईड कर्करोग आणि नॉन-स्मॉल सेल फुफ्फुसाचा कर्करोग51,52,53,55.तथापि, कोलोरेक्टल कॅन्सरमधील त्याचे कार्य आणि आण्विक यंत्रणा अनपेक्षित राहते.म्हणून, आम्ही पुढील अभ्यासासाठी हे lncRNA निवडले.
रूग्णांमध्ये DARS-AS1 अभिव्यक्तीचा अभ्यास करण्यासाठी, आम्ही कॅन्सर जीनोम अॅटलस (TCGA) प्रकल्पातील 10,327 ट्यूमर नमुन्यांचे सर्वसमावेशक विश्लेषण केले.आमचे परिणाम दर्शवितात की DARS-AS1 हे कोलन एडेनोकार्सिनोमा (COAD), रेनल क्लिअर सेल कार्सिनोमा (KIRC), आणि रेनल पॅपिलरी सेल कार्सिनोमा (KIRP) यासह विविध प्रकारच्या ट्यूमरमधील निरोगी पेशींमध्ये मोठ्या प्रमाणावर व्यक्त आणि लक्षणीयरीत्या वाढलेले आहे..खूप कमी (Fig. 1d आणि पूरक Fig. 1a, b). जोडलेल्या निरोगी/ट्यूमर नमुन्यांच्या विश्लेषणाने मूत्राशय यूरोथेलियल कार्सिनोमा (BLCA), किडनी रेनल क्लियर सेल कार्सिनोमा (KIRC), प्रोस्टेट एडेनोकार्सिनोमा (PRAD), फुफ्फुसाच्या स्क्वॅमस सेल कार्सिनोमा (LUSC) च्या ट्यूमरमध्ये DARS-AS1 ची लक्षणीय उच्च अभिव्यक्ती पुष्टी केली. , गर्भाशयाच्या कॉर्पस एंडोमेट्रियल कार्सिनोमा (UCEC), फुफ्फुसाचा एडेनोकार्सिनोमा (LUAD), यकृत हेपॅटोसेल्युलर कार्सिनोमा (LIHC), किडनी रेनल पॅपिलरी सेल कार्सिनोमा (KIRP), आणि कोलन एडेनोकार्सिनोमा (COAD) (p मूल्य < 0.05) (चित्र 1e) . जोडलेल्या निरोगी/ट्यूमर नमुन्यांच्या विश्लेषणाने मूत्राशय यूरोथेलियल कार्सिनोमा (BLCA), किडनी रेनल क्लियर सेल कार्सिनोमा (KIRC), प्रोस्टेट एडेनोकार्सिनोमा (PRAD), फुफ्फुसाच्या स्क्वॅमस सेल कार्सिनोमा (LUSC) च्या ट्यूमरमध्ये DARS-AS1 ची लक्षणीय उच्च अभिव्यक्ती पुष्टी केली. , गर्भाशयाच्या कॉर्पस एंडोमेट्रियल कार्सिनोमा (UCEC), फुफ्फुसाचा एडेनोकार्सिनोमा (LUAD), यकृत हेपॅटोसेल्युलर कार्सिनोमा (LIHC), किडनी रेनल पॅपिलरी सेल कार्सिनोमा (KIRP), आणि कोलन एडेनोकार्सिनोमा (COAD) (p मूल्य < 0.05) (चित्र 1e) .जोडलेल्या निरोगी/ट्यूमर नमुन्यांच्या विश्लेषणाने मूत्राशय यूरोथेलियल कार्सिनोमा (BLCA), क्लिअर सेल रेनल आणि रेनल सेल कार्सिनोमा (KIRC), प्रोस्टेट एडेनोकार्सिनोमा (PRAD), फुफ्फुसाच्या स्क्वॅमस सेल कार्सिनोमा (LUSC) ट्यूमरमध्ये DARS-AS1 ची लक्षणीय उच्च अभिव्यक्ती देखील पुष्टी केली., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– मी). , कॉर्पस गर्भाशयाचा एंडोमेट्रियल कार्सिनोमा (UCEC), फुफ्फुसाचा एडेनोकार्सिनोमा (LUAD), यकृताचा हेपॅटोसेल्युलर कार्सिनोमा (LIHC), मूत्रपिंडाचा पॅपिलरी सेल कार्सिनोमा (KIRP), आणि कोलनचा एडेनोकार्सिनोमा (COAD) (p मूल्य < 0.05) (Fig. 1e–m) .配对 健康/肿瘤样本 的 分析 进一步 了 了 डार्स-एएस 1 在 膀胱 尿路 上 皮癌 (बीएलसीए) . <0.05）（图1e-m） .配 对 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 डार्स-ओएस 1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 腺腺癌 腺腺癌 (प्रॅड) 、 细胞癌 细胞癌.癌 (किर्प）) (coad）) (p 值<0.05）） (图1e-m）) .निरोगी/ट्यूमर जोडलेल्या नमुन्यांच्या विश्लेषणाने मूत्राशय यूरोथेलियल कार्सिनोमा (BLCA), क्लियर सेल रेनल सेल कार्सिनोमा (KIRC), प्रोस्टेट एडेनोकार्सिनोमा (PRAD), आणि फुफ्फुसाच्या स्क्वॅमस सेल कार्सिनोमा (LUSC) ट्यूमरमध्ये DARS-AS1 च्या भूमिकेला समर्थन दिले.экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). कॉर्पस गर्भाशयाच्या कार्सिनोमा (UCEC), फुफ्फुसातील एडेनोकार्सिनोमा (LUAD), हेपॅटोसेल्युलर कार्सिनोमा (LIHC), रेनल पॅपिलरी सेल कार्सिनोमा (KIRP), आणि कोलन एडेनोकार्सिनोमा (COAD) (p मूल्य <0.05) (आकृती 1e -m) मध्ये अभिव्यक्ती.एकत्रितपणे, हे परिणाम सूचित करतात की DARS-AS1 विविध प्रकारच्या कर्करोगांमध्ये मोठ्या प्रमाणावर आणि उच्च प्रमाणात व्यक्त केले जाते.
DARS-AS1 आणि DARS (अँटीसेन्स स्ट्रँड एन्कोड करणारे जनुक) समान प्रवर्तक सामायिक करतात आणि एकमेकांच्या शेजारी स्थित आहेत, आम्ही shRNA ची रचना DARS-AS1 नॉकडाउन करण्यासाठी केली आहे परंतु DARS नाही (पूरक चित्र 2a,b आणि पूरक तक्ता 2) .SW620 व्यतिरिक्त, आम्ही shRNA नॉकडाउन (पूरक तक्ता 3) च्या परिणामकारकता आणि कार्याचा अभ्यास करण्यासाठी DARS-AS1 उच्च व्यक्त करणार्‍या तीन इतर सेल लाइन्स देखील वापरल्या.आमच्या परिणामांनी असे सूचित केले आहे की विकसित केलेल्या तीनही shRNA ने DARS mRNA (पूरक अंजीर 2c–f) च्या प्रमाणात कमीत कमी 80% DARS-AS1 नॉकडाउन कार्यक्षमता प्राप्त केली आहे.याव्यतिरिक्त, आम्हाला आढळले की या shRNAs सह DARS-AS1 नॉकडाउनमुळे कोलोरेक्टल कॅन्सर सेल लाइन SW620 (49.7%) आणि HCT116 (27.7%), ब्रेस्ट कॅन्सर सेल लाइन MBA-MD-231 (53.4%) मध्ये सेल वाढ लक्षणीयरीत्या रोखली गेली.) आणि HepG2 हेपॅटोमा सेल लाईन (92.7% घट), तसेच त्यांची अनंकोर्ड गोलाकार तयार करण्याची क्षमता (~50.8%, 44.6%, 40.7% आणि 75.7% प्रति सेल लाईनची सरासरी घट) (चित्र 2a,b).SW620 मध्ये, वसाहती निर्मिती परीक्षणाच्या परिणामांनी आणखी पुष्टी केली की DARS-AS1 shRNA ने पेशींच्या प्रसाराला लक्षणीयरीत्या प्रतिबंधित केले आणि सरासरी 69.6% (चित्र 2c) घट झाली.
SW620, HCT116, MBA-MD-231 आणि HepG2 पेशींमध्ये सेल प्रसार (a) आणि गोलाकार निर्मिती (b) वर नियंत्रण shRNA आणि DARS-AS1 shRNA चा प्रभाव.c नियंत्रण shRNA आणि DARS-AS1 shRNA चा प्रभाव SW620 पेशींमध्ये कॉलनी निर्मितीवर.सेल प्रसार (d), गोलाकार निर्मिती (e), आणि DARS-AS1 ओव्हरएक्सप्रेस करणार्‍या SW620 पेशींची कॉलनी निर्मिती (f).दाखवलेला डेटा तीन प्रयोगांचे सरासरी ± मानक विचलन आहे.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, आणि *** p ≤ 0.001 दोन-पुच्छ विद्यार्थ्याच्या टी-चाचणीद्वारे.
नुकसान-ऑफ-फंक्शन अभ्यासांना पूरक करण्यासाठी, आम्ही पुढे DARS-AS1 (पूरक चित्र. 2g) ओव्हरएक्सप्रेसिंग SW620 पेशी तयार केल्या.DARS-AS1 ओव्हरएक्सप्रेसने SW620 पेशींमध्ये पेशींची वाढ (1.8-पट), अनकॉर्ड स्फेरॉइड निर्मिती (1.4-पट), आणि कॉलनी निर्मिती (3.3-पट) लक्षणीयरीत्या वाढवली (चित्र 2d–f).आम्ही दुसरी DARS-AS1 व्यक्त करणारी सेल लाइन, A549 वापरून या निकालाची पुष्टी केली.DARS-AS1 ओव्हरएक्सप्रेशनमुळे हे वर्धित सेल प्रसार पुढे A549 पेशींमध्ये दिसून आले (पूरक चित्र 2h, i आणि पूरक तक्ता 3).एकत्रितपणे, हे लाभ आणि नुकसान अभ्यास दर्शवितात की DARS-AS1 विट्रोमध्ये कर्करोगाच्या पेशींच्या प्रसारास प्रोत्साहन देते.
DARS-AS1 सेल प्रसाराचे नियमन करणारी अंतर्निहित यंत्रणा एक्सप्लोर करण्यासाठी, त्याचे संभाव्य प्रोटीन-बाइंडिंग भागीदार ओळखण्यासाठी आम्ही RNA पुल-डाउन विश्लेषण केले.RT-qPCR परिणामांनी दर्शविले की सुमारे 86.2% DARS-AS1 SW620 पेशींच्या साइटोप्लाझममध्ये स्थित आहे (पूरक चित्र 3a).इन विट्रो लिप्यंतरित बायोटिनाइलेटेड DARS-AS1 किंवा स्यूडोआरएनए नंतर SW620 सेल लाइसेट्ससह उष्मायन केले गेले आणि त्यानंतर SDS-PAGE वेगळे केले गेले.त्यानंतरच्या सिल्व्हर स्टेनिंगने दर्शविले की DARS-AS1 पुल नमुन्यांमध्ये एक वेगळा बँड (~38 kDa) लक्षणीयरीत्या समृद्ध झाला होता परंतु डमी RNA किंवा मण्यांच्या नमुन्यांमध्ये नाही (Fig. 3a).हा बँड मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MS) द्वारे PKR एक्टिवेटिंग प्रोटीन (PACT) म्हणून ओळखला गेला आणि पुढे SW620, HCT116, आणि HepG2 सेल लाईन्स (Fig. 3a,b) मध्ये इम्युनोब्लोटिंगद्वारे पुष्टी केली गेली.DARS आणि संबंधित PACT प्रथिने - PKR आणि TRBP - च्या संवर्धनाची देखील वेस्टर्न ब्लॉटिंग (WB) द्वारे RNA विश्लेषण वापरून तपासणी केली गेली.परिणामांनी सूचित केले की DARS-AS1 RNA आणि या तीन प्रथिनांमध्ये कोणताही थेट संवाद आढळला नाही (पूरक चित्र 3b).DARS-AS1 आणि PACT मधील विशिष्ट परस्परसंवादाची RNA इम्युनोप्रीसीपीटेशन (RIP) विश्लेषणाद्वारे पुष्टी केली गेली, ज्याने दर्शविले की DARS-AS1 अँटी-PACT ऍन्टीबॉडीजमध्ये लक्षणीयरीत्या समृद्ध होते परंतु इतर नियंत्रण RNAs (आकृती 3c) मध्ये नाही.इतर कोणत्याही सेल्युलर घटकांच्या अनुपस्थितीत DARS-AS1 थेट PACT शी संवाद साधते की नाही हे निर्धारित करण्यासाठी, शुद्ध PACT वापरून इन विट्रो बायोलेयर इंटरफेरोमेट्री (BLI) परख केली गेली.बायोटिन-लेबल केलेले DARS-AS1 किंवा डमी RNA स्ट्रेप्टाव्हिडिन (SA) बायोसेन्सरवर स्थिर केले गेले आणि नंतर 1 μM PACT असलेल्या कायनेटिक बफरमध्ये उष्मायन केले गेले.विशेष म्हणजे, PACT DARS-AS1 (KD व्हॅल्यू ~26.9 nM) शी बांधील आहे, परंतु RNA (आकृती 3d) ची नक्कल करण्यासाठी नाही.एकत्रितपणे, हे परिणाम DARS-AS1 आणि PACT दरम्यान थेट परस्परसंवाद आणि उच्च आत्मीयता दर्शवतात.
RNA पुल विश्लेषणाने SW620 पेशींमध्ये PACT शी संवाद साधणारे DARS-AS1 ओळखले.वर, संबंधित प्रथिनांचे चांदीचे डाग.लोअर इम्युनोब्लॉट्स अँटी-PACT अँटीबॉडीसह केले गेले.b RNA पुल-डाउन विश्लेषण HCT116 (टॉप) आणि HepG2 (तळाशी) पेशींमध्ये केले गेले.इम्युनोब्लॉटिंगद्वारे PACT संवर्धन शोधले गेले.सूचित प्रतिपिंडांचा वापर करून SW620 पेशींमध्ये cRNA इम्युनोप्रीसीपीटेशन (RIP) परीक्षण केले गेले.d पूर्ण-लांबीच्या DARS-AS1 किंवा नियंत्रण RNA ला PACT बंधनकारक वक्र बायोलेयर इंटरफेरोमेट्री (BLI) वापरून प्राप्त केले गेले.आरएनए स्ट्रेप्टाव्हिडिन बायोसेन्सरवर स्थिर होते.असोसिएशन मोजण्यासाठी 1 μM PACT वापरला गेला.e RNA पुल परख बायोटिनिलेटेड पूर्ण-लांबीच्या DARS-AS1 किंवा ट्रंकेटेड (टॉप) वापरून केली गेली.इम्युनोब्लॉट PACT प्राप्त दर्शवित आहे (तळाशी).f शुद्ध ध्वजांकित PACT बायोटिनिलेटेड पूर्ण-लांबीच्या DARS-AS1 सह उष्मायन केले गेले किंवा इन विट्रो RIP परखासाठी (e प्रमाणे) कापले गेले.काढलेल्या RNA ची RT-qPCR द्वारे पडताळणी करण्यात आली.g बायोलेयर इंटरफेरोमेट्री वापरून PACT साठी वेगवेगळ्या RNA तुकड्यांची सापेक्ष आत्मीयता प्राप्त झाली.विश्लेषणासाठी, 100 nM RNA आणि 1 μM RAST वापरले गेले.h इन विट्रो RIP assays शुद्ध केलेले अखंड किंवा कापलेले लेबल PACT वापरून केले गेले.काढलेल्या RNA ची RT-qPCR द्वारे पडताळणी करण्यात आली.i DARS-AS1, PACT किंवा दोन्ही ओव्हरएक्सप्रेस करणार्‍या SW620 पेशींचा वाढीचा दर.j SW620 पेशींमध्ये पूर्ण-लांबीच्या किंवा कापलेल्या DARS-AS1 चे ओव्हरएक्सप्रेशन सेलच्या वाढीवर वेगवेगळे परिणाम करतात.k अँटी PARP प्रतिपिंडासह इम्युनोब्लोटिंगद्वारे ऍपोप्टोसिस आढळून आले.l DARS-AS1 चा नॉकआउट फ्लो सायटोमेट्रीद्वारे दर्शविल्याप्रमाणे SW620 पेशींचे अपोप्टोसिस प्रेरित करते.दाखवलेला डेटा तीन प्रयोगांचे सरासरी ± मानक विचलन आहे. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001, दोन-पुच्छ विद्यार्थ्यांच्या टी चाचणीद्वारे. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001, दोन-पुच्छ विद्यार्थ्यांच्या टी चाचणीद्वारे. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001 दोन-पुच्छ विद्यार्थ्याच्या टी-चाचणीद्वारे. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001 दोन-पुच्छ विद्यार्थ्याच्या टी-चाचणीद्वारे.
त्यानंतर आम्ही PACT असोसिएशन (आकृती 3e) साठी आवश्यक DARS-AS1 प्रदेश ओळखण्यासाठी इन विट्रो ट्रान्सक्रिप्शनद्वारे तीन बायोटिनिलेटेड DARS-AS1 RNA तुकडे तयार केले.RNA विश्लेषणाच्या परिणामांवरून असे दिसून आले की प्रत्येक तुकडा PACT शी संवाद साधण्यास सक्षम होता, परंतु 3′-टर्मिनल क्षेत्र (384-768 न्यूक्लियोटाइड्स A3 लेबल केलेले) 1-384 पेक्षा जास्त न्यूक्लियोटाइड्स A1 लेबल केलेले दाखवले (चित्र 3e).रिकॉम्बिनंट PACT (आकृती 3f) वापरून इन विट्रो आरआयपी परखमध्ये असेच परिणाम दिसून आले.या परिणामांशी सुसंगत, BLI वापरून PACT ला स्थिर RNA तुकड्यांना बांधण्यासाठी केलेल्या प्रयोगांनी हे देखील दर्शविले की PACT मध्ये A3 (384–768 nt) (KD मूल्य अंदाजे 94.6 nM) साठी जास्त आत्मीयता आहे, तर इतर क्षेत्रांशी जवळजवळ कोणताही संबंध नाही.(Fig. 3d).
आम्ही PACT मध्ये संबंधित बंधनकारक क्षेत्रांचे परीक्षण देखील केले.PACT मध्ये तीन कार्यात्मक डोमेन आहेत, त्यापैकी दोन संरक्षित आहेत डबल-स्ट्रॅंडेड RNA-बाइंडिंग डोमेन (dsRBD) आणि तिसरे डोमेन (नियुक्त D3) जे प्रथिने परस्पर क्रिया सक्रिय करणारे म्हणून कार्य करतात.प्रत्येक डोमेनच्या lncRNA बंधनकारक क्षमतेचे परीक्षण करण्यासाठी, आम्ही तीन उत्परिवर्तन इंजिनियर केले ज्याने प्रत्येक तीन डोमेन काढून टाकले आणि एक इन विट्रो RIP परख केली.आमच्या परिणामांनी दर्शविले की PACT चे तिसरे डोमेन (D3) हटवल्याने इतर दोन उत्परिवर्तनांच्या (चित्र 3h) तुलनेत DARS-AS1 (अखंड PACT च्या तुलनेत 0.11-पटीने) सोबतचा संवाद लक्षणीयरीत्या कमी झाला, असे दिसून आले की रिलीझ D3 चा DARS शी संवाद साधला.-AC1.एकत्रितपणे, हे परिणाम सूचित करतात की DARS-AS1 आणि PACT मधील परस्परसंवाद प्रामुख्याने DARS-AS1 च्या 3′ शेवटी आणि PACT च्या D3 डोमेनद्वारे होऊ शकतो.
आम्ही नोंदवले की DARS-AS1 चा PACT अभिव्यक्तीवर कोणताही परिणाम झाला नाही आणि PACT चा DARS-AS1 (पूरक चित्र 3c) वर कोणताही परिणाम झाला नाही.त्यानंतर आम्ही सेलच्या वाढीवर PACT नॉकडाउनचा परिणाम तपासला.DARS-AS1 च्या विरूद्ध, PACT बंद झाल्यावर सापेक्ष पेशी 1.5-3 पट वेगाने वाढल्या (पूरक चित्र 3d).कॉलनी निर्मिती परीक्षणाच्या परिणामांनी असे सूचित केले आहे की PACT (पूरक चित्र 3e) सह shRNA उपचारानंतर पेशी 2-3-पट वसाहती तयार करतात.DARS-AS1 हे PACT द्वारे सेल प्रसाराचे नियमन करते की नाही हे तपासण्यासाठी, आम्ही PACT, DARS-AS1 किंवा दोन्हीपेक्षा जास्त प्रमाणात व्यक्त करणार्‍या SW620 पेशी व्युत्पन्न केल्या.PACT च्या ओव्हरएक्सप्रेसने सेल प्रसारास महत्त्वपूर्ण प्रतिबंध दर्शविला (आकृती 3i).DARS-AS1 ओव्हरएक्सप्रेस प्रति se लक्षणीयरीत्या सेल प्रसाराला प्रोत्साहन देत असताना, DARS-AS1 आणि PACT च्या ओव्हरएक्सप्रेस करणार्‍या पेशींच्या वाढीच्या दरात कोणताही लक्षणीय फरक नव्हता.हे परिणाम सूचित करतात की PACT DARS-AS1 ओव्हरएक्सप्रेशनमुळे वाढलेल्या प्रसाराचा प्रतिकार करू शकतो.
DARS-AS1 च्या वेगवेगळ्या क्षेत्रांमध्ये भिन्न PACT-बाइंडिंग क्षमता असल्यामुळे, आम्ही DARS-AS1 तुकड्यांच्या वेगवेगळ्या ओव्हरएक्सप्रेशनद्वारे सेल प्रसारावर त्यांचा सापेक्ष प्रभाव तपासला.इतर दोन तुकड्यांच्या तुलनेत, DARS-AS1 3′ शेवटी (384–768 nt), DARS-AS1 मधील मुख्य PACT-संबंधित प्रदेश, ज्यामध्ये सेल प्रसार उत्तेजित करण्याची सर्वोच्च क्षमता होती (Fig. 3j).हे परिणाम DARS-AS1 ची बंधनकारक क्षमता आणि जैविक कार्य यांच्यातील सकारात्मक सहसंबंध दर्शवतात.
PACT एक प्रो-अपोप्टोटिक प्रोटीन 19 असल्याचे नोंदवले गेले आहे.म्हणून, आम्ही एपोप्टोसिसवर DARS-AS1 चा प्रभाव तपासला.अपेक्षेप्रमाणे, DARS-AS1 नॉकडाउनने SW620 पेशींमध्ये PARP क्लीवेज लक्षणीयरीत्या वाढवले ​​आणि SW620, HCT116, HepG2 आणि MBA-MD-231 सेल लाईन्स (चित्र 3k) मधील अॅनेक्सिन V-पॉझिटिव्ह पेशींचे प्रमाण वाढले.3).3f–h), कर्करोगाच्या पेशींमध्ये DARS-AS1 चा अँटी-अपोप्टोटिक प्रभाव PACT च्या ऍपोप्टोसिस-प्रेरित कार्याच्या विरुद्ध असल्याचे दर्शवितो.एकत्रितपणे, हे परिणाम सूचित करतात की DARS-AS1 ऑन्कोजेनिक फंक्शनची यंत्रणा PACT फंक्शनच्या प्रतिबंधाद्वारे असू शकते.
पुढे, आम्ही DARS-AS1-PACT असोसिएशनचे कार्यात्मक परिणाम शोधले.PACT ने थेट परस्परसंवादाद्वारे PKR सक्रिय करण्याचा अहवाल दिला आहे, जे नंतर eIF2α फॉस्फोरिलेशन वाढवते, ज्यामुळे अनुवादात्मक हटवणे आणि अपोप्टोसिस17 होते.प्रथम, आम्ही DARS-AS1 PACT आणि PKR च्या सेल्युलर लोकॅलायझेशनवर परिणाम करतो की नाही हे तपासले.कॉन्फोकल फ्लूरोसेन्स मायक्रोस्कोपीने दर्शविले की PACT आणि PKR 0.72 च्या सरासरी पीअरसन सहसंबंध गुणांकासह SW620 पेशींमध्ये उच्च प्रमाणात एकत्रित होते.दरम्यान, DARS-AS1 ओव्हरएक्सप्रेसने लक्षणीयरित्या PACT आणि PKR सह-स्थानिकीकरण कमी केले (म्हणजे पीअरसन सहसंबंध गुणांक 0.61) (आकृती 4a).DARS-AS1 PACT-PKR परस्परसंवाद सुधारू शकतो की नाही हे तपासण्यासाठी, आम्ही SW620 सेल लाइसेट्समध्ये अँटी-PACT अँटीबॉडीसह को-इम्युनोप्रेसिपीटेशन (को-आयपी) परख केली.नियंत्रण पेशींमध्ये PKR अँटी-PACT मध्ये अत्यंत समृद्ध होते, तर DARS-AS1 (Fig. 4b) ओव्हरएक्सप्रेस करणार्‍या पेशींमधून PKR पुनर्प्राप्ती लक्षणीयरीत्या कमी झाली होती.इन विट्रो प्रोटीन बाइंडिंग असेससाठी शुद्ध लेबल केलेले PACT आणि PKR वापरले गेले.त्यानुसार, ज्यांनी DARS-AS1 प्रदान केले परंतु कोणतेही नियंत्रण RNA नाही त्यांनी दाबलेले PACT-PKR परस्परसंवाद (आकृती 4c) दर्शविला.सर्व परिणामांनी दर्शविले की DARS-AS1 ने PACT आणि PKR संप्रेषणात व्यत्यय आणला.
कॉन्फोकल फ्लोरोसेन्स मायक्रोस्कोपी वापरून नियंत्रण पेशी किंवा DARS-AS1 ओव्हरएक्सप्रेस करणार्‍या पेशींमध्ये PACT आणि PKR चे सह-स्थानिकीकरण दिसून आले.केंद्रक DAPI ने डागलेले होते.16 छायाचित्रांमधून सांख्यिकीय परिणाम प्राप्त झाले.b नियंत्रण SW620 पेशी किंवा DARS-AS1 ओव्हरएक्सप्रेस करणार्‍या पेशींच्या सेल लाइसेट्समध्ये अँटी-PACT अँटीबॉडी वापरून को-इम्युनोप्रीसिपिटेशन (को-आयपी).c लेबल केलेले PACT, शुद्ध PKR आणि DARS-AS1 किंवा मॉक RNA सह विट्रोमध्ये लिप्यंतरण केलेले इन विट्रो प्रोटीन बंधनकारक विश्लेषणासाठी उष्मायन केले गेले.अँटी-फ्लॅग ऍन्टीबॉडीज इम्युनोप्रीसीपीटेशनसाठी वापरण्यात आले.d सूचित प्रतिपिंडांसह इम्युनोब्लॉट्स SW620 आणि HCT116 पेशींमध्ये नियंत्रण shRNA किंवा DARS-AS1-shRNA ने संक्रमण केले गेले आणि त्यानंतर सीरम उपासमार झाली.e DARS-AS1 अभिव्यक्ती पातळीने थाप्सिगार्गिनसाठी सेल्युलर संवेदनशीलता बदलली.SW620 पेशी DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 ओव्हरएक्सप्रेशन प्लाझमिड किंवा कंट्रोल प्लाझमिडसह संक्रमित केल्या गेल्या.पेशींवर 48 तास थेप्सिगार्गिन उपचार केले गेले आणि MTS अभिकर्मक वापरून सेल व्यवहार्यता निश्चित केली गेली.f इन विट्रो लिप्यंतरित DARS-AS1 किंवा डमी RNA आणि शुद्ध PACT चा वापर इन विट्रो एक्टिवेशन परख आणि इम्युनोब्लॉट शोधण्यासाठी केला गेला.g या ​​अँटीबॉडीजचा वापर करून इम्युनोब्लॉट्स SW620-ctrl पेशींवर (डावीकडे) किंवा PKR म्युटंट्स (उजवीकडे) ओव्हरएक्सप्रेस करणार्‍या पेशींवर केले गेले.त्यानंतर या पेशींचे नियंत्रण shRNA किंवा DARS-AS1-shRNA द्वारे संक्रमण होते आणि त्यानंतर सीरम उपासमार होते.h फ्लो सायटोमेट्रीने दर्शविले की उत्परिवर्ती PKR च्या निष्क्रियतेमुळे SW620 पेशींमध्ये DARS-AS1-प्रेरित ऍपोप्टोसिसची भरपाई झाली.i सूचित प्रतिपिंडांसह इम्युनोब्लॉट्स SW620 (डावीकडे) किंवा HCT116 (उजवीकडे) पेशींमध्ये केले गेले.नियंत्रण shRNA किंवा DARS-AS1 shRNA सह संक्रमण झालेल्या पेशी सीरम-वंचित असतात आणि 100 nM PKR C16 इनहिबिटर किंवा DMSO सह पूरक असतात.स्केल बार = 5 µm.दाखवलेला डेटा तीन प्रयोगांचे सरासरी ± मानक विचलन आहे.* p ≤ 0.05 दोन-पुच्छ विद्यार्थ्याची टी-चाचणी.
सामान्यतः असे मानले जाते की एकदा PACT PKR17 शी संवाद साधला की, Thr451 वर PKR फॉस्फोरिलेशन प्रेरित केले जाऊ शकते.आमच्या परिणामांनी सूचित केले आहे की सीरम उपासमार झाल्यानंतर DARS-AS1 नॉकडाउन पेशींमध्ये PKR फॉस्फोरिलेशनची पातळी लक्षणीयरीत्या वाढली होती (Fig. 4d आणि पूरक Fig. 4a).त्यानुसार, आम्हाला आढळले की eIF2α चे फॉस्फोरिलेशन, मुख्य PKR सब्सट्रेट, DARS-AS1 shRNA (Fig. 4d आणि पूरक Fig. 4a) द्वारे देखील लक्षणीय वाढ झाली आहे.थाप्सिगार्गिन हा एक ER ताण आहे ज्यामुळे ER Ca2+ सोडते.थॅप्सिगार्गिनच्या उपचाराने PACT ची अभिव्यक्ती आणि सक्रियता वाढवल्याचा अहवाल दिला गेला आहे, जो पुढे PKR शी संवाद साधतो आणि सक्रिय करतो, ज्यामुळे eIF2α फॉस्फोरिलेशन 18,61 वाढून ऍपोप्टोसिस होतो.येथे, DARS-AS1 हे PACT/PKR मार्ग रोखून पेशींना तणावावर मात करण्यास मदत करू शकते की नाही हे तपासण्यासाठी आम्ही PACT/PKR मार्गाचे उत्तेजक म्हणून thapsigargin वापरले.आम्‍ही पाहिले की DARS-AS1 अभिव्‍यक्‍तीचा स्‍तर सकारात्मक त्‍यापसीगार्गिनच्‍या सेल प्रतिकाराशी संबंधित आहे.DARS-AS1 ओव्हरएक्सप्रेस करणार्‍या SW620 पेशी थॅप्सिगार्गिनवर उपचार केल्यावर चांगल्या प्रकारे जगल्या, तर DARS-AS1 नॉकडाउन असलेल्या पेशी अधिक संवेदनाक्षम बनल्या (चित्र 4e).या परिणामांशी सुसंगत, DARS-AS1 ओव्हरएक्सप्रेसने थॅप्सिगार्गिन-प्रेरित PKR फॉस्फोरिलेशन कमी केले (पूरक अंजीर. 4b).याउलट, थाप्सिगार्गिन उपचारानंतर, नियंत्रण पेशींच्या तुलनेत DARS-AS1 नॉकडाउन पेशींमध्ये PKR आणि eIF2α जास्त प्रमाणात फॉस्फोरिलेटेड होते (पूरक अंजीर. 4b).विशेष म्हणजे, थॅप्सिगार्गिनने डोस-आश्रित पद्धतीने DARS-AS1 अभिव्यक्ती प्रेरित केली, जे DARS-AS1 (पूरक अंजीर 4c) चे अँटी-स्ट्रेस फंक्शन दर्शवू शकते.या व्यतिरिक्त, या निरीक्षणांची पुष्टी करण्यासाठी आम्ही इन विट्रो अ‍ॅक्टिव्हेशन अॅसेज केले.थोडक्यात, PKR अँटी-पीकेआर अँटीबॉडी वापरून सेल लाइसेट्सपासून शुद्ध केले गेले, नंतर विट्रोमध्ये लिप्यंतरित रीकॉम्बीनंट PACT आणि DARS-AS1 सह उष्मायन केले गेले.एंजाइमॅटिक प्रतिक्रिया नंतर, डब्ल्यूबी वापरून फॉस्फो-पीकेआर शोधला गेला.आमच्या परिणामांनी सूचित केले की पीकेआर फॉस्फोरिलेशन DARS-AS1 द्वारे लक्षणीयरीत्या प्रतिबंधित केले गेले होते, परंतु नियंत्रण RNA (आकृती 4f) द्वारे नाही.हे इन विट्रो आणि इन विवो परिणाम सूचित करतात की DARS-AS1 PACT-मध्यस्थ PKR सक्रियकरणास प्रतिबंध करते.त्याच वेळी, आम्ही DARS-AS1 (आकृती 4f) च्या उपस्थितीत PACT पुनर्प्राप्तीमध्ये घट देखील पाहिली.हा परिणाम इन विट्रो प्रोटीन बाइंडिंग परख (आकृती 4c) च्या परिणामांशी सुसंगत आहे आणि PACT-PKR असोसिएशनसाठी DARS-AS1 चे ब्लॉकिंग कार्य पुन्हा स्पष्ट करतो.
PACT च्या D3 डोमेनमधील Ser246 आणि Ser287 सेल्युलर तणावाखाली PKR सक्रिय करण्यासाठी आवश्यक आहेत.अॅलनाइनसाठी दोन सेरीन अवशेषांच्या बदलीमुळे म्युटंट PACT (mutD) प्राप्त झाले, ज्यामुळे तणावाच्या अनुपस्थितीत PKR सक्रिय झाला आणि अॅलानाईन (mutA) च्या प्रतिस्थापनाने प्रोटोकॉल उलट केला.आम्ही या डोमेनचे महत्त्व DARS-AS1 च्या थेट सहवासात दाखवून दिले असल्याने, हे अवशेष DARS-AS1 सह परस्परसंवादात सहभागी होऊ शकतात की नाही हे तपासण्यासाठी आम्ही हे दोन PACT उत्परिवर्ती तयार केले.विशेष म्हणजे, दोन्ही उत्परिवर्तींनी DARS-AS1 (पूरक अंजीर 4d) ला बांधण्याची क्षमता गमावली, जे सूचित करते की DARS-AS1 सह कार्यक्षम परस्परसंवादासाठी PACT प्रोटीनची संपूर्ण रचना आवश्यक असू शकते.
शिवाय, आमचे परिणाम असेही सूचित करतात की DARS-AS1-shRNA-प्रेरित सेल प्रसार प्रतिबंध अंशतः प्रबळ नकारात्मक PACT उत्परिवर्ती (PACTmutA) किंवा प्रबळ नकारात्मक PKR उत्परिवर्ती (PKRmut) (पूरक अंजीर 4e. e) जास्त व्यक्त करून पुनर्संचयित केले जाऊ शकते.प्रबळ-नकारात्मक PKR उत्परिवर्तींच्या ओव्हरएक्सप्रेसने DARS-AS1 नॉकडाउनद्वारे प्रेरित PKR फॉस्फोरिलेशन तसेच सीरम-वंचित पेशींमध्ये eIF2α फॉस्फोरिलेशन कमी केले (चित्र 4g).अधिक महत्त्वाचे म्हणजे, DARS-AS1 नॉकडाउनद्वारे प्रेरित अपोप्टोटिक पेशींचे प्रमाण PKRmut (Fig. 4h आणि पूरक Fig. 4g) ओव्हरएक्सप्रेस करणार्‍या पेशींमध्ये देखील कमी झाले.PKR kinase क्रियाकलाप प्रतिबंधित केल्याने DARS-AS1 कार्य देखील बिघडते, कारण परिणामांनी दर्शविले की DARS-AS1 नॉकडाउनने PKR आणि eIF2α फॉस्फोरिलेशन क्वचितच ट्रिगर केले जेव्हा पेशींना PKR-विशिष्ट C16 इनहिबिटर (Fig. 4i आणि पूरक Fig 4) ने उपचार केले गेले.).एकत्रितपणे, आमचे परिणाम सूचित करतात की DARS-AS1 सेल प्रसारास प्रोत्साहन देते, कमीतकमी अंशतः, PACT-मध्यस्थ PKR सक्रियकरणास प्रतिबंध करून.
ट्यूमोरीजेनेसिसमध्ये DARS-AS1 ची भूमिका अधिक एक्सप्लोर करण्यासाठी, आम्ही माऊस xenograft मॉडेल वापरून vivo प्रयोग केले. परिणाम दर्शविते की DARS-AS1 च्या नॉकडाउनने उंदरांमध्ये ट्यूमरची वाढ नाटकीयरित्या कमी केली (p मूल्य <0.0001) (चित्र 5a). परिणाम दर्शविते की DARS-AS1 च्या नॉकडाउनने उंदरांमध्ये ट्यूमरची वाढ नाटकीयरित्या कमी केली (p मूल्य <0.0001) (चित्र 5a). Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) (рис. 5а). परिणाम दर्शविते की DARS-AS1 नॉकडाउन उंदरांमध्ये ट्यूमरची वाढ मोठ्या प्रमाणात कमी करते (p मूल्य <0.0001) (आकृती 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001）（图5a）.结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a）. Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (значение р <0,0001) (рис. 5а). परिणामांनी दर्शविले की DARS-AS1 नॉकडाउनने उंदरांमध्ये ट्यूमरची वाढ लक्षणीयरीत्या कमी केली (p मूल्य <0.0001) (आकृती 5a).अशाप्रकारे, DARS-AS1 नॉकडाउन गटामध्ये, ट्यूमरच्या सरासरी प्रमाणामध्ये सुमारे 72.9% आणि सरासरी ट्यूमरच्या वस्तुमानात सुमारे 87.8% (आकृती 5b-d) लक्षणीय घट झाली आहे.हे परिणाम जोरदारपणे सूचित करतात की DARS-AS1 विवोमध्ये ट्यूमरच्या वाढीस लक्षणीय प्रोत्साहन देऊ शकते.
नग्न उंदरांमध्ये कोलोरेक्टल ऑन्कोजेनेसिसवर DARS-AS1 नॉकडाउन जाहिरातीचा प्रभाव.वाढ वक्र (a), ट्यूमर आकार (b), वजन (c), आणि ट्यूमर प्रतिमा (d) दर्शविल्या आहेत.एरर बार ±SEM दर्शवतात. n = 10. ****p < 0.0001, दोन-पुच्छ विद्यार्थ्यांच्या टी चाचणीद्वारे. n = 10. ****p < 0.0001, दोन-पुच्छ विद्यार्थ्यांच्या टी चाचणीद्वारे. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0.0001 दोन-पुच्छ विद्यार्थ्याची टी-चाचणी.n = 10. ****p <0.0001, 通过双尾学生t 检验. ****p <0.0001, 通过双尾学生t检验. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0.0001 दोन-पुच्छ विद्यार्थ्यांची टी-चाचणी.e Kaplan-Meier ने DARS-AS1 अभिव्यक्ती पातळी आणि UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM आणि LGG असलेल्या रूग्णांमधील एकूण जगण्याच्या परस्परसंबंधाचे विश्लेषण केले.रुग्णांमध्ये DARS-AS1 अभिव्यक्तीची उच्च पातळी शीर्ष 50% मध्ये होती;रुग्णांमध्ये DARS-AS1 अभिव्यक्तीची निम्न पातळी खालच्या 50% मध्ये होती.लॉग रँक चाचणी वापरून p-मूल्ये निश्चित केली गेली.f प्रस्तावित मॉडेल ज्यामध्ये DARS-AS1 PACT-PKR मार्ग आणि ट्यूमरच्या वाढीचे नियमन करते.
DARS-AS1 चा नैदानिक ​​​​प्रभाव अधिक चांगल्या प्रकारे समजून घेण्यासाठी, आम्ही त्याची अभिव्यक्ती आणि रुग्णाचे अस्तित्व यांच्यातील परस्परसंबंध तपासले.TCGA डेटासेटचे विश्लेषण करून, आम्हाला आढळले की उच्च DARS-AS1 अभिव्यक्ती यूव्हल मेलेनोमा (UVM), रेनल क्रोमोफोबिया (KICH), रेनल पॅपिलरी सेल कार्सिनोमा (KIRP), मेसोथेलियोमा (MESO), मल्टिप्लेक्सशी संबंधित आहे.ग्लिओब्लास्टोमा मॉर्फोसिस (GBM) आणि निम्न-श्रेणीतील ब्रेन ग्लिओमा (LGG) (आकृती 5e) असलेल्या रूग्णांमध्ये कमी अस्तित्व लक्षणीयरीत्या संबंधित होते.हे परिणाम सूचित करतात की DARS-AS1 क्लिनिकल ट्यूमरच्या प्रगतीमध्ये महत्त्वाची भूमिका बजावू शकते आणि बहुविध कर्करोगांमध्ये संभाव्य भविष्यसूचक बायोमार्कर असू शकते.
या अभ्यासात, मोठ्या प्रमाणात CRISPRi फंक्शनल स्क्रीनिंगचा वापर करून, आम्ही निर्धारित केले की DARS-AS1 lncRNA दोन प्रमुख तणाव प्रतिसादकांचे, PACT आणि PKR चे नियमन करून कर्करोगाच्या पेशींच्या तणावावर मात करते.PACT शी थेट संवाद साधून, DARS-AS1 ने PACT-मध्यस्थ PKR सक्रियकरण प्रतिबंधित केले, ज्यामुळे अपोप्टोटिक सेल मृत्यू रोखला गेला आणि सेल प्रसारास प्रोत्साहन दिले (चित्र 5f).DARS-AS1 चे अपरेग्युलेशन अनेक प्रकारच्या कर्करोगांमध्ये दिसून आले आहे, जे सूचित करते की तणावपूर्ण परिस्थितीत कर्करोगाच्या पेशींच्या अस्तित्वाला चालना देण्याचे कार्य बहुविध प्रकारच्या कर्करोगांना व्यापकपणे लागू होऊ शकते.
PACT ला PKR एक्टिवेटर प्रोटीन म्हणून ओळखले गेले आहे, आणि PACT-मध्यस्थ PKR सक्रियकरण लिप्यंतरण, भाषांतर, ऍपोप्टोसिस आणि इतर महत्वाच्या सेल्युलर प्रक्रियांचे नियमन करून तणावाच्या प्रतिसादांमध्ये महत्त्वाची भूमिका बजावते.अनेक दशकांपासून, PACT-PKR कॅस्केडचे कर्करोग-विशिष्ट नियम समजून घेण्याचे प्रयत्न केले जात आहेत.येथे, आमच्या अभ्यासाने सेल्युलर lncRNA DARS-AS1 द्वारे कर्करोगाच्या पेशींमध्ये PACT-PKR चे नियमन करण्याची एक वेगळी यंत्रणा उघड केली, जी थेट PACT ला बांधते, PACT-PKR परस्परसंवाद अवरोधित करते, PKR सक्रियकरण आणि eIF2α फॉस्फोरिलेशन प्रतिबंधित करते, ज्यामुळे तणाव-प्रेरित apoptosis प्रतिबंधित करते. अंतिम कर्करोग प्रसार उत्तेजक.पेशीहा शोध कर्करोगाचे निदान आणि थेरपीसाठी संभाव्य lncRNA लक्ष्यांवर प्रकाश टाकतो.
आमच्या डेटाने दर्शविले आहे की DARS-AS1 नॉकडाउन फॉस्फोरिलेटेड PKR आणि eIF2α मध्ये लक्षणीय वाढीसह पेशींना सीरम उपासमारीसाठी संवेदनशील करते.हे परिणाम सूचित करतात की DARS-AS1 PACT/PKR क्रियाकलाप रोखून कठोर परिस्थितीत कर्करोगाच्या पेशी टिकून राहण्यास प्रोत्साहन देते.ASPACT आणि nc886 सारखे इतर अनेक नॉन-कोडिंग RNAs, PACT48 mRNA कमी करून किंवा PKR49,50,64 ला बंधनकारक करून ऑटोफॉस्फोरिलेशनचे नियमन करून PACT/PKR अक्षांमध्ये सामील आहेत.त्यापैकी, DARS-AS1 PACT-PKR असोसिएशनचे व्यत्यय म्हणून कार्य करते.हा अभ्यास PACT/PKR अक्ष नियमन आणि ताण प्रतिसादांमध्ये lncRNAs च्या भूमिकेबद्दलची आमची समज समृद्ध करतो.
PACT मध्ये तीन स्वतंत्र डोमेन आहेत.पहिल्या दोन dsRBD पैकी प्रत्येक PACT चे PKR ला उच्च संबंध जोडण्यासाठी पुरेसे आहे, तर तिसरे डोमेन (D3) विट्रो आणि व्हिव्होमध्ये PKR सक्रियतेसाठी आवश्यक आहे.आमच्या अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की DARS-AS1 प्राधान्याने D3 डोमेनशी संवाद साधते (चित्र 3h).lncRNA (768 nucleotides) चा मोठा आकार पाहता, DARS-AS1 D3 ला बंधनकारक dsRBD आणि PKR च्या PACT डोमेनमधील परस्परसंवादाला शारीरिकरित्या प्रतिबंधित करू शकते, ज्यामुळे PACT आणि PKR चे संबंध अवरोधित होतात.PACT पॉइंट उत्परिवर्तन ज्याने Ser246 आणि Ser287 ची जागा D3 मध्ये अॅलानाईन किंवा एस्पार्टेटने घेतली, DARS-AS1 साठी त्याच्या बंधनकारक आत्मीयतेमध्ये व्यत्यय आणला, त्यांच्या सहवासातील D3 च्या एकूण संरचनात्मक आणि विद्युत गुणधर्मांचे महत्त्व दर्शवितात.भविष्यात अधिक अचूक बायोकेमिकल विश्लेषण आणि उच्च रिझोल्यूशन PACT संरचनात्मक विश्लेषण वापरून या यंत्रणेचे अधिक तपशील आवश्यक असतील.
मागील अभ्यासांनी नोंदवले आहे की DARS-AS1 अनेक यंत्रणांद्वारे पेशींच्या प्रसारास प्रोत्साहन देते51,52,53.एका उदाहरणात, अन्वेषकांनी निरीक्षण केले की DARS-AS1 ने मूत्रपिंडाच्या कर्करोगाच्या पेशींमध्ये miP-194-5p ला लक्ष्य करून त्याच्या अँटिसेन्स प्रोटीन-एनकोडिंग DARS जनुकाचे नियमन केले.तथापि, सध्याच्या अभ्यासात, DARS-AS1 नॉकडाउनचा कमीत कमी कोलोरेक्टल, स्तन आणि यकृताच्या कर्करोगासह अनेक प्रकारच्या कर्करोगांमध्ये DARS ट्रान्सक्रिप्शनवर कमी परिणाम झाला.कारण lncRNAs सेल- आणि टिश्यू-विशिष्ट अभिव्यक्ती नमुने प्रदर्शित करतात, कार्यात्मक यंत्रणा कर्करोगाच्या प्रकारांमध्ये संरक्षित केली जाऊ शकत नाहीत, जी आमची निरीक्षणे आणि वेगवेगळ्या कर्करोगांच्या मागील मूल्यांकनांमधील या विसंगतीमध्ये योगदान देऊ शकतात.विविध शारीरिक आणि पॅथॉलॉजिकल प्रक्रियांच्या विशिष्ट यंत्रणा स्पष्ट करण्यासाठी विशेष अभ्यास आवश्यक आहेत.
क्लिनिकल डेटाच्या विश्लेषणात असे दिसून आले आहे की ट्यूमरमधील DARS-AS1 अभिव्यक्ती कर्करोगाच्या रूग्णांच्या जगण्याशी विपरितपणे संबंधित आहे, जे कर्करोगाच्या निदानामध्ये DARS-AS1/PACT/PKR अक्षाचे महत्त्व अधोरेखित करते.शेवटी, आमचा अभ्यास दर्शवितो की DARS-AS1 हे PACT/PKR सिग्नलिंग अक्षाचे नियामक आहे, कर्करोगाच्या पेशींच्या प्रसारास प्रोत्साहन देते आणि तणावाच्या प्रतिसादादरम्यान ऍपोप्टोसिस प्रतिबंधित करते, जे संशोधनाची आणखी एक ओळ प्रदान करते आणि संभाव्य उपचारांमध्ये भविष्यातील संशोधनासाठी स्वारस्य आहे. .
मानवी सेल लाईन्स SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 आणि HEK293T चीनमधील नॅशनल सेल लाइन रिसोर्स इन्फ्रास्ट्रक्चरमधून मिळवल्या गेल्या.सर्व पेशी DMEM माध्यमात (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) 10% FBS (जेमिनी, ब्रुकलिन, NY) आणि 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमायसिन (थर्मो फिशर सायंटिफिक) 37°C, 5% CO2 सह पूरक होते.इनक्यूबेटर
अँटी-पॅक्ट, अबकॅम (ab31967);अँटी-पीकेआर, अबकॅम (ab184257);अँटी-पीकेआर (फॉस्फो-टी४५१), अबकॅम (एबी८१३०३);अँटी-फ्लॅग, अबकॅम (ab125243);विरोधी eIF2α, Abcam (A0764));विरोधी eIF2α (फॉस्फरस S51), Abcam (ab32157);विरोधी PACT (फॉस्फरस S246), Abgent (AP7744b);अँटी-बीटा-ट्यूब्युलिन, सीएसटी (2128);सामान्य माउस IgG, CST (5415S);सामान्य ससा IgG, CST (2729S).वेस्टर्न ब्लॉटिंगसाठी PBST मध्ये अँटीबॉडीज 1:1000 आणि IP साठी 1:100 पातळ करण्यात आले.
sgRNAs CRISPR-ERA66 नावाचे सार्वजनिकरित्या उपलब्ध साधन वापरून विकसित केले गेले.आम्ही sgRNA डेव्हलपमेंटसाठी डीफॉल्ट टूल पॅरामीटर्स आणि 3 kb प्रदेशातील sgRNA बाइंडिंग साइट्सची गणना अल्गोरिदम वापरली.TSS वर केंद्रीत.sgRNA oligonucleotides चे पूल CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) येथे संश्लेषित केले गेले आणि मानवीकृत pgRNA प्लास्मिड्स (Addgene #44248) मध्ये क्लोन केले गेले.एकूण 12 µg पूल केलेले मानवीकृत pgRNA प्लास्मिड, 7.2 µg psPAX2 (Addgene #12260), आणि 4.8 µg pMD2.G (Addgene #12259) 5 x 106 HEK106 HEK193cm डिसफेक्शन डिसफेक्टमध्ये सह-संक्रमित केले गेले. सेल ( CWBIO, बीजिंग, चीन) निर्मात्याच्या सूचनांचे पालन करते.व्हायरस-युक्त सुपरनेटंट्स रक्तसंक्रमणानंतर 48 आणि 72 तासांनी गोळा केले गेले आणि 0.45 µm फिल्टरद्वारे फिल्टर केले गेले.स्क्रीनिंगसाठी, dCas9/KRAB फ्यूजन प्रोटीन व्यक्त करणार्‍या SW620 पेशी व्हायरस ट्रान्सडक्शनद्वारे प्राप्त केल्या गेल्या.सुधारित SW620 पेशी 0.1-0.3 च्या MOI वर चार स्वतंत्र संसर्ग प्रयोगांमध्ये व्हायरस लायब्ररीमध्ये संक्रमित झाल्या होत्या आणि 2 दिवसांसाठी 2 μg/ml प्युरोमायसिन (सिग्मा, सेंट लुईस, MO) सह नमुना घेण्यात आला होता.त्यानंतर, स्क्रिनिंगसाठी 500 पेशी/sgRNA च्या किमान लायब्ररी कव्हरेजसह 18 दिवस विट्रोमध्ये पेशींचे संवर्धन करण्यात आले.
जीनोमिक डीएनए QIAamp DNA ब्लड मिडी किट (QIAGEN, डसेलडॉर्फ, जर्मनी; 51183) च्या सूचनांनुसार काढला गेला.एकूण, लायब्ररी तयार करण्यासाठी प्रति जैविक पुनरावृत्ती 100 μg जीनोमिक डीएनए वापरण्यात आला.sgRNA प्रदेश PCR च्या दोन फेऱ्यांनी वाढवला गेला आणि बारकोडशी जोडला गेला.
NucleoSpin® gel आणि PCR शुध्दीकरण किट (MACHEREY-NAGEL, Düren, Germany; 740609.250) वापरून PCR उत्पादने शुद्ध करण्यात आली आणि Qubit™ HS डबल-स्ट्रॅंडेड DNA डिटेक्शन किट (थर्मो फिशर सायंटिफिक; Q32854) वापरून परिमाण निश्चित करण्यात आली.
एमटीएस परख सेल प्रसार मोजण्यासाठी वापरली गेली.2000 पेशी/विहिरीच्या प्रारंभिक घनतेवर 96-विहीर प्लेट्समध्ये सेल सीड केले गेले.एकूण 4-6 दिवसांसाठी दर्शविलेल्या वेळी पेशींची सापेक्ष संख्या दररोज मोजली गेली.प्रत्येक विहिरीसाठी, 20 μl MTS अभिकर्मक (प्रोमेगा) 100 μl DMEM सह पातळ केले गेले, 37°C तापमानावर 4 तासांसाठी पेशींनी उष्मायन केले गेले आणि नंतर OD490 मोजले गेले.
गोलाकारांच्या निर्मितीचे विश्लेषण करून अनियंत्रित वाढीची क्षमता शोधण्यात आली.थोडक्यात, shRNA DARS-AS1 किंवा नियंत्रण shRNA ने संक्रमण केलेल्या 2000 पेशींना अल्ट्रा लो अटॅचमेंट मायक्रोप्लेट्स (कॉर्निंग) मध्ये दर 4 दिवसांनी मध्यम बदल करून संवर्धन केले गेले.14 दिवसांनंतर गोलाकार मोजण्यात आले.DARS-AS1 ओव्हरएक्सप्रेशन प्लाझमिड किंवा कंट्रोल प्लाझमिडसह ट्रान्सफेक्ट केलेल्या 500 पेशी वर्धित परीक्षणासाठी वापरल्या गेल्या, अन्यथा पद्धत अपरिवर्तित होती.
Riboprobe® संयोजन प्रणाली (Promega P1440) च्या सूचनांनुसार T7 RNA पॉलिमरेझ आणि बायोटिन-16-UTP (Roche 1138908910) वापरून RNA लिप्यंतरण केले गेले.येथे वापरलेले प्राइमर्स पूरक तक्ता 4 मध्ये सूचीबद्ध आहेत.
प्रोटीन-कोडिंग PACT किंवा PKR क्षेत्रे pET15b (Addgene #73619) मध्ये क्लोन करण्यात आली आणि BL21(DE3) मध्ये रूपांतरित केली गेली.बॅक्टेरिया रात्रभर अॅम्पिसिलीन पुरवलेल्या एलबीमध्ये उबवले गेले आणि नंतर ताजे एलबीने 100 पट पातळ केले गेले.जेव्हा माध्यमाचा OD600 0.8 वर पोहोचला तेव्हा प्रथिने अभिव्यक्ती प्रेरित करण्यासाठी 1 mM IPTG जोडले गेले.रात्रभर हलक्या थरथरणाऱ्या (20°C वर 250 rpm) उष्मायनानंतर, सेल पेलेट सेंट्रीफ्यूगेशन (4000 rpm, 10 मिनिटे, 4°C) द्वारे गोळा केले गेले.सेल पेलेटला लिसिस बफर (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) मध्ये पुन्हा वापरा आणि 30 मिनिटांसाठी बर्फावर उबवा, नंतर सॉनिकेट (15 मिनिटे, 5 सें. चालू/बंद, बर्फावर) आणि सेंट्रीफ्यूज (130,000, rpm)., 30 मिनिटे, 4°С).नंतर सुपरनेटंट नि-एनटीए रेझिन (QIAGEN) वर 4°C वर 3 वेळा लोड केले गेले, वॉश बफरने 4 वेळा धुतले (50 mM Tris, pH 8.0, 40 mM imidazole, 250 mM NaCl) आणि एकूण 3 वेळा एल्युट केले गेले. 10 मिली एल्युएंट बफर (50 एमएम ट्रिस, पीएच 8.0, 250 एमएम NaCl, 300 एमएम इमिडाझोल).शुद्ध प्रोटीन WB वापरून निर्धारित केले गेले आणि Qubit™ प्रोटीन परख किट (थर्मो फिशर सायंटिफिक; Q 33212) वापरून एकाग्रता निश्चित केली गेली.
RIP assays पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे, सुधारणांसह केले गेले.थोडक्यात, 1x RIP बफर (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5% NP-40, RNasin ribonuclease inhibitor (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, protease10xystack 0.5% (Roche, 1 mM DTT) आणि 13,000 rpm वर 4 °C वर 15 मिनिटांसाठी सेंट्रीफ्यूज.सुपरनॅटंटला नंतर प्रोटीन A+G चुंबकीय मणी (मिलीपोर) 5 μg अँटी-PACT प्रतिपिंड (Abeam) किंवा IgG (CST) सह संयुग्मित करण्यात आले.मणी 5x RIP बफरने 5 वेळा धुतले गेले, नंतर प्रोटीनेज के (NEB) ने पचवले.आरएनए ट्रायझोलने काढले गेले आणि RT-qPCR द्वारे निर्धारित केले गेले.प्राइमर्स पूरक तक्ता 5 मध्ये सादर केले आहेत.
इन विट्रो आरआयपी परख सुधारित मानक आरआयपी परख प्रोटोकॉलनुसार केली गेली.एकूण 5 pmol इन विट्रो लिप्यंतरित RNA RIP बफरसह 1x पातळ केले गेले आणि 5 मिनिटे 65°C वर उष्मायनाद्वारे ऍनिल केले गेले आणि त्यानंतर खोलीच्या तापमानाला हळू थंड केले गेले.एकूण 5 pmol अखंड किंवा उत्परिवर्तित ध्वज-लेबल असलेली PACT प्रथिने E. coli पासून शुद्ध करण्यात आली.4 डिग्री सेल्सिअस तापमानात 2 तास पुनर्निर्मित RNA सह उष्मायन करा आणि अँटी-फ्लॅग IP साठी RIP विश्लेषणासाठी वरील प्रक्रियेचे अनुसरण करा.
RNA विस्तार विश्लेषणासाठी, 1xRIP बफरसह 1×107 पेशी लाइझ केल्या गेल्या.4°C वर 15 मिनिटांसाठी 13,000 rpm वर सेंट्रीफ्यूगेशन केल्यानंतर, 4°C वर 2 तासांसाठी 30 μl स्ट्रेप्टाव्हिडिन चुंबकीय मणी (बेकमन) सह सुपरनॅटंट प्रीट्रीट केले गेले.शुद्धीकृत लाइसेट नंतर यीस्ट tRNA सोबत पुरवले गेले आणि 40 pmol renatured RNA सह रात्रभर 4°C वर उष्मायन केले गेले, त्यानंतर आणखी 2 तास आणि BSA सह ब्लॉक केलेले 20 μl नवीन स्ट्रेप्टाव्हिडिन चुंबकीय मणी जोडले गेले.वॉशिंग स्टेपमध्ये 5x RIP बफरसह 4 वेळा आणि 1x RIP बफरसह 4 वेळा समाविष्ट होते.संबंधित प्रथिने बायोटिन इल्यूशन बफर (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 12.5 mM D-biotin, PMSF) सह निर्मूलन केले गेले आणि NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen) वर वेगळे केले गेले.सिल्व्हर स्टेनिंग (बेयोटाईम बायोटेक्नॉलॉजी) नंतर, एमएस द्वारे विशिष्ट बँड एक्साइज आणि विश्लेषण केले गेले.
PACT आणि PKR मधील परस्परसंवादाची चाचणी घेण्यासाठी सह-आयपी विश्लेषण केले गेले.थोडक्यात, 1 x RIP बफरमध्ये 1 x 107 lysed पेशी उष्मायन करून, त्यानंतर 13,000 rpm वर 4°C वर 15 मिनिटांसाठी सेंट्रीफ्यूगेशन करून सुपरनॅटंट लाइसेट्स तयार केले गेले.Lysates प्रथिने A + G चुंबकीय मणींनी भरलेले होते, 5 µg अँटी-PACT अँटीबॉडीसह संयुग्मित होते आणि 4°C वर रात्रभर हलक्या हाताने फिरवले होते.मणी 5×RIP बफरने 3 वेळा, 1×RIP बफरने दोनदा आणि 1×SDS बफरने धुतले गेले.पुनर्प्राप्त प्रोटीनचे विश्लेषण SDS-PAGE जेलद्वारे केले गेले आणि WB द्वारे शोधले गेले.
ध्वजांकित PACT चे दोन pmol आणि PKR चे 1 pmol E. coli पासून शुद्ध केले गेले.1× RIP बफरमध्ये पातळ करा आणि 10 pmol renatured RNA सह 4 °C तापमानात 2 तास उबवा.त्यानंतर, त्यांना अतिरिक्त दोन तास प्रोटीन A+G चुंबकीय मणी-संयुग्मित अँटी-लेबल अँटीबॉडीसह उष्मायन करण्यात आले.नंतर मणी 1x RIP बफरने चार वेळा धुतले गेले आणि 1x SDS बफरने काढले गेले.परिणामी PACT आणि PKR WB द्वारे शोधले गेले.